研究背景

在當(dāng)今社會(huì)，城市污水、水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水和醫(yī)療廢水已成為沙門(mén)氏菌的重要儲(chǔ)存庫(kù)和傳播源。沙門(mén)氏菌是一種常見(jiàn)的人類(lèi)食源性病原體，廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)，并通過(guò)糞便排泄到環(huán)境中。它能在未經(jīng)處理的糞便和廢水中存活五個(gè)月至兩年之久，感染后可引發(fā)多種疾病，如菌血癥、胃腸炎、食物中毒等。因此，快速檢測(cè)廢水中的沙門(mén)氏菌對(duì)于有效降低疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)、保障公共衛(wèi)生安全至關(guān)重要。

然而，目前的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法存在諸多局限性。傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)雖被視為檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”，但檢測(cè)周期長(zhǎng)達(dá)4至7天，難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌污染；免疫學(xué)方法因缺乏特異性靶向抗體、存在交叉反應(yīng)等問(wèn)題而應(yīng)用受限；分子生物學(xué)技術(shù)如多位點(diǎn)序列分型（MLST）和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）等需要昂貴設(shè)備和專(zhuān)業(yè)人員操作；生物傳感器方法也因成本高昂難以廣泛推廣。此外，以往的DNA分子檢測(cè)方法無(wú)法區(qū)分活菌和滅活菌的DNA，可能導(dǎo)致對(duì)沙門(mén)氏菌風(fēng)險(xiǎn)的高估，而RNA檢測(cè)方法又存在提取復(fù)雜、成本高等問(wèn)題。

創(chuàng)新檢測(cè)平臺(tái)的誕生

在這樣的背景下，一項(xiàng)創(chuàng)新的研究成果應(yīng)運(yùn)而生。2025年5月21日，《Microorganisms》雜志發(fā)表了一篇題為《Establishment of a Sensitive and Visual Detection Platform for Viable Salmonella in Wastewater That Combines Propidium Monoazide with Recombinase Polymerase Amplification—CRISPR/Cas12a System》的文章，介紹了一種新型的檢測(cè)平臺(tái)，該平臺(tái)結(jié)合了碘化丙啶單氮雜卓（PMA）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）和CRISPR/Cas12a系統(tǒng)，專(zhuān)門(mén)針對(duì)廢水中的活菌沙門(mén)氏菌進(jìn)行快速、靈敏且可視化的檢測(cè)。

創(chuàng)新點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)

這項(xiàng)研究的創(chuàng)新之處在于巧妙地整合了多種先進(jìn)技術(shù)。PMA能夠選擇性地與死細(xì)胞的DNA結(jié)合，阻止其在后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)中被檢測(cè)到，從而有效區(qū)分活菌和死菌；RPA則是一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具有快速、操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，相比傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，它不需要復(fù)雜的熱循環(huán)設(shè)備，且能在較短時(shí)間內(nèi)完成DNA的擴(kuò)增；CRISPR/Cas12a系統(tǒng)則以其高特異性和靈敏度著稱(chēng)，能夠精準(zhǔn)識(shí)別目標(biāo)DNA序列，并通過(guò)其獨(dú)特的側(cè)切活性激活熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。三者的結(jié)合，不僅彌補(bǔ)了各自單獨(dú)使用時(shí)的不足，還充分發(fā)揮了各自的優(yōu)勢(shì)，為沙門(mén)氏菌的檢測(cè)提供了一種全新的解決方案。

研究結(jié)果

高特異性和靈敏度

特異性：對(duì)15種常見(jiàn)病原體進(jìn)行檢測(cè)，僅沙門(mén)氏菌屬（鼠傷寒沙門(mén)氏菌、副傷寒沙門(mén)氏菌B型、腸炎沙門(mén)氏菌）顯示熒光信號(hào)，其他菌株均無(wú)反應(yīng)，表明該系統(tǒng)具有高度特異性。

圖1 15種常見(jiàn)病原體的可視化檢測(cè)結(jié)果（a）、熒光值和Ct值（b）。（泳道1至15分別對(duì)應(yīng)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、副傷寒沙門(mén)氏菌B型、腸炎沙門(mén)氏菌、弗氏志賀氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、蠟樣芽孢桿菌、糞腸球菌、產(chǎn)氣腸桿菌和枯草芽孢桿菌，C表示陰性對(duì)照。）注：不同大寫(xiě)字母表示熒光值之間存在顯著差異（方差分析，P<0.05），不同小寫(xiě)字母表示Ct值之間存在顯著差異（方差分析，P <0.05）。

靈敏度：在污水中，該系統(tǒng)對(duì)活沙門(mén)氏菌的最低檢測(cè)限為101 CFU/mL，且在101至10? CFU/mL濃度范圍內(nèi)均能產(chǎn)生明顯的熒光信號(hào)。

圖2 濃度范圍為10⁰至10⁸ CFU/mL的沙門(mén)氏菌的可視化檢測(cè)結(jié)果（a）、熒光值和Ct值（b）。圖表中，條形圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。

實(shí)際應(yīng)用

污水中活沙門(mén)氏菌的檢測(cè)應(yīng)用

人工接種廢水檢測(cè)：在人工接種不同濃度活沙門(mén)氏菌的廢水中，該系統(tǒng)能準(zhǔn)確檢測(cè)到101至10? CFU/mL的活沙門(mén)氏菌，而滅活沙門(mén)氏菌無(wú)信號(hào)。PCR和凝膠電泳結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了該系統(tǒng)的有效性。

圖3 濃度范圍為10¹至10⁸ CFU/mL的廢水中滅活及活沙門(mén)氏菌的可視化檢測(cè)結(jié)果（a）、凝膠電泳結(jié)果（b）、熒光值和Ct值（c,d）。圖表中，條形圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。

實(shí)際廢水樣本檢測(cè)：對(duì)24份實(shí)際廢水樣本進(jìn)行檢測(cè)，其中8份樣本（#2、6、10、12、13、16、20、24）顯示明顯的熒光信號(hào)，熒光強(qiáng)度和qPCR值一致，表明該系統(tǒng)在實(shí)際環(huán)境中具有良好的適用性。

圖4 24份實(shí)際廢水樣本檢測(cè)結(jié)果的可視化檢測(cè)（a）以及熒光值和Ct值（b）。圖表中，條形圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。

討論與挑戰(zhàn)

盡管PMA處理能夠有效區(qū)分活菌和死菌，但在實(shí)際應(yīng)用中，仍需進(jìn)一步研究如何優(yōu)化PMA的處理?xiàng)l件，以確保其在不同類(lèi)型的廢水樣本中都能發(fā)揮最佳效果。此外，對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用而言，還需要開(kāi)發(fā)便攜式的熒光檢測(cè)設(shè)備，以便于在沒(méi)有專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的情況下進(jìn)行快速檢測(cè)。同時(shí)，實(shí)際廢水樣本中復(fù)雜的污染物成分可能會(huì)對(duì)DNA提取和擴(kuò)增過(guò)程產(chǎn)生干擾，如何快速、高效地從環(huán)境樣本中提取純凈的DNA，減少抑制物的影響，也是未來(lái)需要解決的問(wèn)題。而且，一些廢水樣本的高濁度和顏色可能會(huì)阻礙藍(lán)光的有效照射，進(jìn)而影響PMA與DNA的結(jié)合效果和檢測(cè)靈敏度，這也是未來(lái)研究需要重點(diǎn)關(guān)注的方向。

總結(jié)與展望

這項(xiàng)研究成功建立了一種快速、靈敏且可視化的檢測(cè)平臺(tái)，能夠有效檢測(cè)廢水中的活菌沙門(mén)氏菌，為廢水處理廠和農(nóng)村污水處理設(shè)施中的病原體監(jiān)測(cè)和早期預(yù)警提供了有力的技術(shù)支持。通過(guò)優(yōu)化PMA處理?xiàng)l件和整合RPA與CRISPR/Cas12a技術(shù)，該系統(tǒng)不僅提高了檢測(cè)效率，還降低了檢測(cè)成本，有望在實(shí)際的廢水監(jiān)測(cè)工作中得到廣泛應(yīng)用。

隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和相關(guān)研究的深入，相信該檢測(cè)平臺(tái)將不斷完善。研究人員可能會(huì)進(jìn)一步探索PMA與其他檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合，拓展其應(yīng)用范圍；同時(shí)，開(kāi)發(fā)更加便攜、快速、準(zhǔn)確的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)設(shè)備，使其能夠更好地適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境條件，為保障公共衛(wèi)生安全和環(huán)境保護(hù)做出更大的貢獻(xiàn)。此外，對(duì)于其他類(lèi)似的病原體檢測(cè)，該研究也提供了一種可借鑒的思路和方法，有望推動(dòng)整個(gè)微生物檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：Liang J, Sui X, Xu Y, et al. Establishment of a Sensitive and Visual Detection Platform for Viable Salmonella in Wastewater That Combines Propidium Monoazide with Recombinase Polymerase Amplification—CRISPR/Cas12a System[J]. Microorganisms, 2025, 13(5): 1166.

來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~蔡偉程。