導(dǎo)讀：在食品安全領(lǐng)域，人諾如病毒（HuNoV）因其極強(qiáng)的傳播力和低感染劑量而成為重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象。然而，目前廣泛應(yīng)用的RT-qPCR檢測(cè)方法雖靈敏卻無(wú)法判斷病毒是否具有感染力，造成風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估偏高。為解決這一問(wèn)題，研究人員嘗試引入“活性RT-qPCR”技術(shù)，即通過(guò)添加染料來(lái)區(qū)分病毒是否仍具感染性。本研究系統(tǒng)評(píng)估了三種染料在不同病毒滅活條件下的表現(xiàn)，并與目前唯一可用于HuNoV復(fù)制檢測(cè)的人腸道類器官（HIE）模型進(jìn)行對(duì)比，探討活性RT-qPCR作為感染力評(píng)估工具的可行性及其局限性。

圖1. 遵循的工作流程使用三種活力標(biāo)記，比較通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)、RT-qPCR和活力 RT-qPCR 評(píng)估的病毒傳染性^[1]。

活性RT-qPCR：原理與技術(shù)路徑

RT-qPCR檢測(cè)諾如病毒時(shí)無(wú)法判斷其是否失活，因此近年來(lái)學(xué)界提出了“活性RT-qPCR”策略，即通過(guò)引入能夠穿透病毒殼體的染料，如PMAxx?、PtCl?和CL（Cyanine-based dyes），與暴露的RNA結(jié)合并抑制其擴(kuò)增信號(hào)，從而間接排除非感染性病毒的干擾。本研究分別使用這三種染料處理四種病毒株（GI.3、GII.4、GII.6 和 Tulane virus），并比較其在經(jīng)過(guò)熱處理、高壓處理后的表現(xiàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在極端滅活條件下（如95℃高溫或500 MPa高壓），染料處理可顯著降低RT-qPCR信號(hào)，表明該技術(shù)對(duì)強(qiáng)烈失活處理較為敏感。然而在中間滅活強(qiáng)度下（如60℃或300–400 MPa處理），活性RT-qPCR仍然不能準(zhǔn)確區(qū)分感染性與非感染性病毒，表現(xiàn)出“過(guò)度估計(jì)風(fēng)險(xiǎn)”的傾向。這提示該方法的適用性在真實(shí)食品加工環(huán)境中仍需謹(jǐn)慎評(píng)估。

類器官模型：當(dāng)前最可靠的感染力標(biāo)準(zhǔn)

研究以人腸道類器官（HIE）模型作為病毒感染力的“金標(biāo)準(zhǔn)”。該模型可模擬人腸道上皮環(huán)境，允許諾如病毒在體外復(fù)制，是當(dāng)前唯一能直接檢測(cè)HuNoV復(fù)制活性的系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，只有在染料處理后RT-qPCR信號(hào)幾乎完全消失（如95℃滅活組）時(shí)，HIE中也檢測(cè)不到病毒復(fù)制；而在中等滅活組中，即使染料處理后qPCR信號(hào)仍存在，HIE中卻無(wú)法檢測(cè)到感染性病毒。這一對(duì)比明確表明，活性RT-qPCR方法只能在滅活程度非常充分的條件下才與真實(shí)感染力相吻合。在處理強(qiáng)度較低、但仍可能影響病毒活性的實(shí)際條件下，如部分巴氏殺菌或中壓處理，活性染料無(wú)法提供準(zhǔn)確判斷。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，染料CL的性能較為均衡，PMAxx?抑制力最弱，而PtCl?雖強(qiáng)但可能干擾HIE中的病毒活性，反而降低檢測(cè)一致性。

技術(shù)局限與實(shí)際應(yīng)用展望

研究還模擬了食品場(chǎng)景，在草莓泥中對(duì)病毒進(jìn)行高壓處理，并比較了活性RT-qPCR與HIE的檢測(cè)結(jié)果。發(fā)現(xiàn)食品基質(zhì)對(duì)病毒具有一定保護(hù)作用，降低了滅活效果，同時(shí)也增加了染料穿透病毒顆粒的難度。說(shuō)明在復(fù)雜樣品中，活性RT-qPCR面臨信號(hào)干擾、假陰性或假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)。綜合分析，作者認(rèn)為活性RT-qPCR作為傳統(tǒng)RT-qPCR的增強(qiáng)工具，在某些特定滅活處理下具有潛力，但尚不能取代HIE模型進(jìn)行病毒感染力判斷。其應(yīng)用價(jià)值在于作為前處理或篩選手段，為高風(fēng)險(xiǎn)食品或樣本提供初步感染力判別；而在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估或消毒工藝驗(yàn)證等關(guān)鍵場(chǎng)景，仍需借助更可靠的病毒培養(yǎng)系統(tǒng)或多方法聯(lián)合驗(yàn)證。未來(lái)研究方向建議包括優(yōu)化染料選擇和處理流程，提高染料對(duì)中等滅活病毒的判別能力，或結(jié)合納米探針、微流控芯片等新型技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒感染力的快速準(zhǔn)確評(píng)估。

參考文獻(xiàn)：[1] Wales S Q, Pandiscia A, Kulka M, et al. Challenges for estimating human norovirus infectivity by viability RT-qPCR as compared to replication in human intestinal enteroids[J]. International journal of food microbiology, 2024, 411: 110507.

來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~教楊。