食品安全一直是全球關(guān)注的焦點，尤其是對致病菌的快速、準確檢測至關(guān)重要。近年來，李斯特菌（Listeria monocytogenes）作為一種重要的食源性病原菌，因其引發(fā)的嚴重感染性疾病而備受關(guān)注。傳統(tǒng)的檢測方法通常耗時長且需要復(fù)雜的設(shè)備和專業(yè)操作人員，這使得在現(xiàn)場快速檢測變得困難。本文將介紹一種結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）技術(shù)和超嗜熱菌Argonaute（PfAgo）系統(tǒng)的新型檢測平臺，該平臺能夠?qū)崿F(xiàn)對李斯特菌的超靈敏、高特異性檢測，為食品安全檢測提供了一種便攜、快速、準確的解決方案。
李斯特菌的危害及檢測需求
李斯特菌是一種革蘭氏陽性菌，廣泛存在于各種食品中，尤其是即食食品和冷藏食品。它對免疫力低下的人群，如孕婦、老人和兒童，具有較高的感染風(fēng)險，臨床表現(xiàn)包括腦膜炎、敗血癥和流產(chǎn)等，具有高發(fā)病率和高死亡率。由于李斯特菌在酸性介質(zhì)、高鹽濃度和低溫環(huán)境下具有強大的生存和繁殖能力，因此在食品加工的各個環(huán)節(jié)都可能發(fā)生污染，增加了食品安全風(fēng)險。因此，亟需一種快速、準確的現(xiàn)場檢測方法，以便及時采取控制措施，確保食品安全。
LAMP-PfAgo檢測平臺的原理
LAMP技術(shù)是一種新興的等溫擴增方法，具有時間短、靈敏度高的優(yōu)點。然而，LAMP技術(shù)在特異性和假陽性問題上仍存在一定的挑戰(zhàn)。為了解決這些問題，研究人員引入了PfAgo系統(tǒng)。PfAgo是一種源自超嗜熱菌的核酸內(nèi)切酶，能夠識別特定的目標(biāo)序列并產(chǎn)生強烈的檢測信號。與CRISPR/Cas系統(tǒng)相比，PfAgo系統(tǒng)不受特定目標(biāo)序列的限制，具有更廣泛的目標(biāo)序列選擇范圍，并且能夠識別單個堿基的錯配，從而提高了檢測的準確性。
LAMP-PfAgo檢測平臺的開發(fā)
研究人員將LAMP技術(shù)與PfAgo系統(tǒng)結(jié)合，開發(fā)了一種新型的李斯特菌分子檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括熒光檢測和側(cè)流條檢測兩種方法，能夠在現(xiàn)場實現(xiàn)快速、特異、靈敏和便攜的診斷。通過引入低成本的金屬浴作為簡單的擴增設(shè)備，該方法能夠在較短時間內(nèi)檢測李斯特菌樣本，展示了其作為便攜、快速、準確和可視化核酸檢測方法的潛力。
圖1 基于LAMP-PfAgo的單核增生乳桿菌檢測工作流程(A) LAMP-PfAgo法檢測單核增生乳桿菌核酸可視化的具體過程。(B) gDNA引導(dǎo)下PfAgo“雙步”裂解示意圖。(C)基因組提取或快速樣品裂解后進行分析所需的最小設(shè)備包括可移動電源、加熱塊、移液器和吸管。
實驗結(jié)果與分析
檢測靈敏度與特異性
研究結(jié)果表明，LAMP-PfAgo系統(tǒng)能夠檢測到低至1.8×101拷貝的李斯特菌hly基因水平，檢測靈敏度高于傳統(tǒng)的實時熒光定量PCR（qPCR）方法。
圖2. LAMP-PfAgo檢測單核細胞增生李斯特菌的特異性。(A)用于驗證LAMP-PfAgo熒光檢測特異性的終點熒光強度讀數(shù)。(B)在紫外光和藍光下肉眼觀察LAMP-PfAgo熒光檢測的特異性。(C)肉眼觀察以驗證LAMP-PfAgo-LFS檢測的特異性。NTC：無核糖核酸酶的雙蒸水（ddH2O）陰性對照。誤差線表示平均值±標(biāo)準誤；n=3, ****表示P < 0.0001。
此外，該方法在檢測18個食品來源樣本時，表現(xiàn)出與qPCR相當(dāng)?shù)男阅埽覠o其他病原體的交叉反應(yīng)，顯示出良好的特異性。
圖3 LAMP-PfAgo檢測單核細胞增生李斯特菌的靈敏度。(A) LAMP-PfAgo靈敏度的終點熒光強度讀數(shù)；(B)在紫外光和藍光下肉眼觀察LAMP-PfAgo熒光檢測的靈敏度。(C)肉眼觀察LAMP-PfAgo-LFS檢測的靈敏度。NTC：無核糖核酸酶的雙蒸水（）陰性對照。誤差線表示平均值±標(biāo)準誤；n=3, ****表示P < 0.0001。
現(xiàn)場檢測的可行性
為了驗證LAMP-PfAgo系統(tǒng)在現(xiàn)場檢測中的可行性，研究人員對收集的牛肉、雞肉和牛奶樣本進行了檢測。結(jié)果顯示，該系統(tǒng)能夠準確檢測出3個李斯特菌陽性樣本，檢測結(jié)果與qPCR方法一致，驗證了其高靈敏度和高特異性。此外，該方法對設(shè)備要求低，能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場即時檢測，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
圖4 采用qPCR、LAMP-PfAgo熒光檢測法和LAMP-PfAgo-LFS檢測法對食品源樣本進行驗證。(A) LAMP-PfAgo熒光檢測法的結(jié)果，包括顯示標(biāo)準化平均熒光值的熒光熱圖，以及在紫外光和藍光下的觀察結(jié)果。(B)樣本的qPCR檢測結(jié)果。(C)樣本的LAMP-PfAgo-LFS檢測結(jié)果。泳道1-18：樣本編號。
結(jié)論：LAMP-PfAgo檢測平臺的開發(fā)為食品安全檢測提供了一種革命性的方法。該平臺結(jié)合了LAMP技術(shù)的高效擴增和PfAgo系統(tǒng)的高特異性，能夠在短時間內(nèi)實現(xiàn)對李斯特菌的超靈敏檢測。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，LAMP-PfAgo系統(tǒng)具有設(shè)備簡單、操作便捷、檢測快速和結(jié)果直觀等優(yōu)點，特別適用于現(xiàn)場檢測和流行病學(xué)監(jiān)測。未來，該平臺有望在食品安全、醫(yī)療衛(wèi)生和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，為保障公共健康和食品安全提供有力支持。
未來展望前景
隨著分子診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，LAMP-PfAgo檢測平臺展示了其在快速、便攜和高效檢測方面的巨大潛力。未來，研究人員可以進一步優(yōu)化該平臺的檢測性能，擴大其應(yīng)用范圍，并結(jié)合其他新興技術(shù)，如微流控芯片和智能手機應(yīng)用，開發(fā)出更加智能化和自動化的檢測設(shè)備。此外，加強對李斯特菌等食源性病原菌的早期監(jiān)測和控制，將有助于減少食源性疾病的爆發(fā)，保障食品安全和公共健康。
總之，LAMP-PfAgo檢測平臺的問世，為食品安全檢測帶來了新的希望。通過不斷的技術(shù)創(chuàng)新和應(yīng)用推廣，我們有理由相信，這一新型檢測平臺將在未來的食品安全保障中發(fā)揮重要作用，為構(gòu)建更加安全、健康的食品供應(yīng)鏈貢獻力量。
參考文獻：Yu Z, Shao Y, Dong Y, et al. LAMP combined with Pyrococcus furiosus Argonaute for the ultrasensitive and highly specific point-of-care test platform for Listeria monocytogenes detection[J]. LWT, 2024, 207: 116640
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~蔡偉程。
