食品安全一直是全球關(guān)注的焦點(diǎn)，尤其是對(duì)致病菌的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)至關(guān)重要。近年來(lái)，李斯特菌（Listeria monocytogenes）作為一種重要的食源性病原菌，因其引發(fā)的嚴(yán)重感染性疾病而備受關(guān)注。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法通常耗時(shí)長(zhǎng)且需要復(fù)雜的設(shè)備和專業(yè)操作人員，這使得在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)變得困難。本文將介紹一種結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)和超嗜熱菌Argonaute（PfAgo）系統(tǒng)的新型檢測(cè)平臺(tái)，該平臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)李斯特菌的超靈敏、高特異性檢測(cè)，為食品安全檢測(cè)提供了一種便攜、快速、準(zhǔn)確的解決方案。

李斯特菌的危害及檢測(cè)需求

李斯特菌是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，廣泛存在于各種食品中，尤其是即食食品和冷藏食品。它對(duì)免疫力低下的人群，如孕婦、老人和兒童，具有較高的感染風(fēng)險(xiǎn)，臨床表現(xiàn)包括腦膜炎、敗血癥和流產(chǎn)等，具有高發(fā)病率和高死亡率。由于李斯特菌在酸性介質(zhì)、高鹽濃度和低溫環(huán)境下具有強(qiáng)大的生存和繁殖能力，因此在食品加工的各個(gè)環(huán)節(jié)都可能發(fā)生污染，增加了食品安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，亟需一種快速、準(zhǔn)確的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法，以便及時(shí)采取控制措施，確保食品安全。

LAMP-PfAgo檢測(cè)平臺(tái)的原理

LAMP技術(shù)是一種新興的等溫?cái)U(kuò)增方法，具有時(shí)間短、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。然而，LAMP技術(shù)在特異性和假陽(yáng)性問(wèn)題上仍存在一定的挑戰(zhàn)。為了解決這些問(wèn)題，研究人員引入了PfAgo系統(tǒng)。PfAgo是一種源自超嗜熱菌的核酸內(nèi)切酶，能夠識(shí)別特定的目標(biāo)序列并產(chǎn)生強(qiáng)烈的檢測(cè)信號(hào)。與CRISPR/Cas系統(tǒng)相比，PfAgo系統(tǒng)不受特定目標(biāo)序列的限制，具有更廣泛的目標(biāo)序列選擇范圍，并且能夠識(shí)別單個(gè)堿基的錯(cuò)配，從而提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

LAMP-PfAgo檢測(cè)平臺(tái)的開(kāi)發(fā)

研究人員將LAMP技術(shù)與PfAgo系統(tǒng)結(jié)合，開(kāi)發(fā)了一種新型的李斯特菌分子檢測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括熒光檢測(cè)和側(cè)流條檢測(cè)兩種方法，能夠在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)現(xiàn)快速、特異、靈敏和便攜的診斷。通過(guò)引入低成本的金屬浴作為簡(jiǎn)單的擴(kuò)增設(shè)備，該方法能夠在較短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)李斯特菌樣本，展示了其作為便攜、快速、準(zhǔn)確和可視化核酸檢測(cè)方法的潛力。

圖1 基于LAMP-PfAgo的單核增生乳桿菌檢測(cè)工作流程(A) LAMP-PfAgo法檢測(cè)單核增生乳桿菌核酸可視化的具體過(guò)程。(B) gDNA引導(dǎo)下PfAgo“雙步”裂解示意圖。(C)基因組提取或快速樣品裂解后進(jìn)行分析所需的最小設(shè)備包括可移動(dòng)電源、加熱塊、移液器和吸管。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

檢測(cè)靈敏度與特異性

研究結(jié)果表明，LAMP-PfAgo系統(tǒng)能夠檢測(cè)到低至1.8×101拷貝的李斯特菌hly基因水平，檢測(cè)靈敏度高于傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）方法。

圖2. LAMP-PfAgo檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的特異性。(A)用于驗(yàn)證LAMP-PfAgo熒光檢測(cè)特異性的終點(diǎn)熒光強(qiáng)度讀數(shù)。(B)在紫外光和藍(lán)光下肉眼觀察LAMP-PfAgo熒光檢測(cè)的特異性。(C)肉眼觀察以驗(yàn)證LAMP-PfAgo-LFS檢測(cè)的特異性。NTC：無(wú)核糖核酸酶的雙蒸水（ddH2O）陰性對(duì)照。誤差線表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；n=3, ****表示P < 0.0001。

此外，該方法在檢測(cè)18個(gè)食品來(lái)源樣本時(shí)，表現(xiàn)出與qPCR相當(dāng)?shù)男阅埽覠o(wú)其他病原體的交叉反應(yīng)，顯示出良好的特異性。

圖3 LAMP-PfAgo檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的靈敏度。(A) LAMP-PfAgo靈敏度的終點(diǎn)熒光強(qiáng)度讀數(shù)；(B)在紫外光和藍(lán)光下肉眼觀察LAMP-PfAgo熒光檢測(cè)的靈敏度。(C)肉眼觀察LAMP-PfAgo-LFS檢測(cè)的靈敏度。NTC：無(wú)核糖核酸酶的雙蒸水（）陰性對(duì)照。誤差線表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；n=3, ****表示P < 0.0001。

現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的可行性

為了驗(yàn)證LAMP-PfAgo系統(tǒng)在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的可行性，研究人員對(duì)收集的牛肉、雞肉和牛奶樣本進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，該系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出3個(gè)李斯特菌陽(yáng)性樣本，檢測(cè)結(jié)果與qPCR方法一致，驗(yàn)證了其高靈敏度和高特異性。此外，該方法對(duì)設(shè)備要求低，能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

圖4 采用qPCR、LAMP-PfAgo熒光檢測(cè)法和LAMP-PfAgo-LFS檢測(cè)法對(duì)食品源樣本進(jìn)行驗(yàn)證。(A) LAMP-PfAgo熒光檢測(cè)法的結(jié)果，包括顯示標(biāo)準(zhǔn)化平均熒光值的熒光熱圖，以及在紫外光和藍(lán)光下的觀察結(jié)果。(B)樣本的qPCR檢測(cè)結(jié)果。(C)樣本的LAMP-PfAgo-LFS檢測(cè)結(jié)果。泳道1-18：樣本編號(hào)。

結(jié)論：LAMP-PfAgo檢測(cè)平臺(tái)的開(kāi)發(fā)為食品安全檢測(cè)提供了一種革命性的方法。該平臺(tái)結(jié)合了LAMP技術(shù)的高效擴(kuò)增和PfAgo系統(tǒng)的高特異性，能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)李斯特菌的超靈敏檢測(cè)。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，LAMP-PfAgo系統(tǒng)具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作便捷、檢測(cè)快速和結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。未來(lái)，該平臺(tái)有望在食品安全、醫(yī)療衛(wèi)生和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，為保障公共健康和食品安全提供有力支持。

未來(lái)展望前景

隨著分子診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，LAMP-PfAgo檢測(cè)平臺(tái)展示了其在快速、便攜和高效檢測(cè)方面的巨大潛力。未來(lái)，研究人員可以進(jìn)一步優(yōu)化該平臺(tái)的檢測(cè)性能，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，并結(jié)合其他新興技術(shù)，如微流控芯片和智能手機(jī)應(yīng)用，開(kāi)發(fā)出更加智能化和自動(dòng)化的檢測(cè)設(shè)備。此外，加強(qiáng)對(duì)李斯特菌等食源性病原菌的早期監(jiān)測(cè)和控制，將有助于減少食源性疾病的爆發(fā)，保障食品安全和公共健康。

總之，LAMP-PfAgo檢測(cè)平臺(tái)的問(wèn)世，為食品安全檢測(cè)帶來(lái)了新的希望。通過(guò)不斷的技術(shù)創(chuàng)新和應(yīng)用推廣，我們有理由相信，這一新型檢測(cè)平臺(tái)將在未來(lái)的食品安全保障中發(fā)揮重要作用，為構(gòu)建更加安全、健康的食品供應(yīng)鏈貢獻(xiàn)力量。

參考文獻(xiàn)：Yu Z, Shao Y, Dong Y, et al. LAMP combined with Pyrococcus furiosus Argonaute for the ultrasensitive and highly specific point-of-care test platform for Listeria monocytogenes detection[J]. LWT, 2024, 207: 116640

來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~蔡偉程。