在食品安全領(lǐng)域，致病菌的快速、準(zhǔn)確檢測一直是研究的重點。近期，《Food Chemistry》雜志上發(fā)表的一篇研究論文介紹了一種新型的雙重實時熒光定量PCR-高分辨率熔解分析（duplex qPCR-HRMA）技術(shù)，為檢測肉類中的單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）提供了新的解決方案。
致病菌檢測的重要性
單核細(xì)胞增生李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌是兩種常見的食源性致病菌，它們在全球范圍內(nèi)對食品安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。單核細(xì)胞增生李斯特菌主要通過污染的肉類、乳制品等傳播，可導(dǎo)致嚴(yán)重的李斯特菌病，尤其對孕婦、兒童、老年人和免疫力低下者危害極大。鼠傷寒沙門氏菌則廣泛存在于動物源性食品中，每年導(dǎo)致約1.5億人患病，平均6萬人死亡。傳統(tǒng)的檢測方法如培養(yǎng)法雖然準(zhǔn)確，但耗時長，無法滿足現(xiàn)代食品行業(yè)快速檢測的需求。因此，開發(fā)一種快速、靈敏且準(zhǔn)確的檢測技術(shù)顯得尤為重要。
雙重qPCR-HRMA技術(shù)原理
qPCR是一種基于熒光信號的實時定量PCR技術(shù)，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測目標(biāo)DNA序列。HRMA則是一種基于PCR產(chǎn)物熔解曲線差異的分析技術(shù)，可以在不使用額外探針的情況下區(qū)分不同的DNA序列。雙重qPCR-HRMA技術(shù)將兩者結(jié)合，通過設(shè)計針對單核細(xì)胞增生李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌的特異性引物，分別擴(kuò)增兩種致病菌的特定基因片段，然后通過HRMA分析其熔解曲線的差異，從而實現(xiàn)對兩種致病菌的同時檢測。
靈敏度與準(zhǔn)確性
研究中，雙重qPCR-HRMA技術(shù)表現(xiàn)出極高的靈敏度和準(zhǔn)確性。實驗結(jié)果表明，該技術(shù)的反應(yīng)靈敏度可達(dá)2皮克（pg）DNA，相當(dāng)于單核細(xì)胞增生李斯特菌124個拷貝和鼠傷寒沙門氏菌100個拷貝。
表1 雙重qPCR-HRM檢測方法的反應(yīng)靈敏度。靈敏度評估采用單核細(xì)胞增生李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌的DNA十倍梯度稀釋系列，起始濃度為20 ng。測試了每個稀釋系列中兩種菌的雙重檢測情況，并記錄熔解值。
圖1 用于確定反應(yīng)靈敏度的高分辨率熔解分析。(A) 標(biāo)準(zhǔn)化溫度曲線圖表顯示紅色簇中雙重檢測的雙拐點，(B) 溫度偏移差異曲線圖表顯示熔解曲線形狀和顏色的差異（紅色簇——在五個稀釋系列內(nèi)檢測到單核細(xì)胞增生李斯特菌在76℃和鼠傷寒沙門氏菌在80℃的雙拐點反應(yīng)）。在第六個稀釋系列中僅檢測到（藍(lán)色簇），表明該反應(yīng)足夠靈敏，可檢測到直至第五個稀釋系列的兩種病原體。
在模擬污染的肉類樣本中，該技術(shù)的檢測限為每毫升150個菌落形成單位（CFU），這一檢測限遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)培養(yǎng)法和其他一些分子生物學(xué)方法。此外，該技術(shù)還通過了國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 22118:2011的標(biāo)準(zhǔn)化和驗證，確保了其在實際應(yīng)用中的可靠性和準(zhǔn)確性。
實際應(yīng)用
為了驗證該技術(shù)的實際應(yīng)用價值，研究人員進(jìn)行了多方面的實驗驗證。首先，通過比對不同致病菌的熔解曲線，驗證了引物的特異性。接著，通過稀釋系列實驗確定了反應(yīng)靈敏度，并在模擬污染的肉類樣本中測試了方法靈敏度。此外，還通過改變反應(yīng)體系和設(shè)備等條件，評估了該技術(shù)的穩(wěn)健性。最終，通過盲測驗證和實際樣本檢測，進(jìn)一步證明了該技術(shù)在檢測真實世界樣本中的有效性和可靠性。
表2 對25份商業(yè)樣品（C-1至C-30）和4份監(jiān)管樣品（R-1至R-4）的實際樣品評估。所開發(fā)的qPCR-HRM檢測結(jié)果經(jīng)VITEK 2細(xì)菌鑒定系統(tǒng)（美國生物梅里埃公司）驗證。
未來展望：食品安全檢測的新方向
雙重qPCR-HRMA技術(shù)的誕生，標(biāo)志著食源性致病菌檢測從“單一、滯后”向“多重、即時”時代的跨越。隨著全球食品安全標(biāo)準(zhǔn)的日益嚴(yán)格，這類兼具高效性與經(jīng)濟(jì)性的分子檢測技術(shù)，將成為食品生產(chǎn)、加工、監(jiān)管各環(huán)節(jié)的“標(biāo)配”工具，為消費者餐桌筑起更堅實的安全防線。正如研究團(tuán)隊所言，該技術(shù)不僅是實驗室的創(chuàng)新成果，更是“推動全球食品供應(yīng)鏈微生物風(fēng)險管理的重要一步”。
參考文獻(xiàn)：Ajay G, Vishnuraj M R, Kumar N A, et al. A novel duplex qPCR-HRMA technique for simultaneous detection of Listeria monocytogenes and Salmonella typhimurium in meat products[J]. Food Chemistry, 2025, 474: 143245.
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~蔡偉程。
