在食品安全領域，致病菌的快速、準確檢測一直是研究的重點。近期，《Food Chemistry》雜志上發(fā)表的一篇研究論文介紹了一種新型的雙重實時熒光定量PCR-高分辨率熔解分析（duplex qPCR-HRMA）技術，為檢測肉類中的單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）提供了新的解決方案。
致病菌檢測的重要性
單核細胞增生李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌是兩種常見的食源性致病菌，它們在全球范圍內對食品安全構成了嚴重威脅。單核細胞增生李斯特菌主要通過污染的肉類、乳制品等傳播，可導致嚴重的李斯特菌病，尤其對孕婦、兒童、老年人和免疫力低下者危害極大。鼠傷寒沙門氏菌則廣泛存在于動物源性食品中，每年導致約1.5億人患病，平均6萬人死亡。傳統(tǒng)的檢測方法如培養(yǎng)法雖然準確，但耗時長，無法滿足現(xiàn)代食品行業(yè)快速檢測的需求。因此，開發(fā)一種快速、靈敏且準確的檢測技術顯得尤為重要。
雙重qPCR-HRMA技術原理
qPCR是一種基于熒光信號的實時定量PCR技術，能夠快速、準確地檢測目標DNA序列。HRMA則是一種基于PCR產(chǎn)物熔解曲線差異的分析技術，可以在不使用額外探針的情況下區(qū)分不同的DNA序列。雙重qPCR-HRMA技術將兩者結合，通過設計針對單核細胞增生李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌的特異性引物，分別擴增兩種致病菌的特定基因片段，然后通過HRMA分析其熔解曲線的差異，從而實現(xiàn)對兩種致病菌的同時檢測。
靈敏度與準確性
研究中，雙重qPCR-HRMA技術表現(xiàn)出極高的靈敏度和準確性。實驗結果表明，該技術的反應靈敏度可達2皮克（pg）DNA，相當于單核細胞增生李斯特菌124個拷貝和鼠傷寒沙門氏菌100個拷貝。
表1 雙重qPCR-HRM檢測方法的反應靈敏度。靈敏度評估采用單核細胞增生李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌的DNA十倍梯度稀釋系列，起始濃度為20 ng。測試了每個稀釋系列中兩種菌的雙重檢測情況，并記錄熔解值。
圖1 用于確定反應靈敏度的高分辨率熔解分析。(A) 標準化溫度曲線圖表顯示紅色簇中雙重檢測的雙拐點，(B) 溫度偏移差異曲線圖表顯示熔解曲線形狀和顏色的差異（紅色簇——在五個稀釋系列內檢測到單核細胞增生李斯特菌在76℃和鼠傷寒沙門氏菌在80℃的雙拐點反應）。在第六個稀釋系列中僅檢測到（藍色簇），表明該反應足夠靈敏，可檢測到直至第五個稀釋系列的兩種病原體。
在模擬污染的肉類樣本中，該技術的檢測限為每毫升150個菌落形成單位（CFU），這一檢測限遠低于傳統(tǒng)培養(yǎng)法和其他一些分子生物學方法。此外，該技術還通過了國際標準ISO 22118:2011的標準化和驗證，確保了其在實際應用中的可靠性和準確性。
實際應用
為了驗證該技術的實際應用價值，研究人員進行了多方面的實驗驗證。首先，通過比對不同致病菌的熔解曲線，驗證了引物的特異性。接著，通過稀釋系列實驗確定了反應靈敏度，并在模擬污染的肉類樣本中測試了方法靈敏度。此外，還通過改變反應體系和設備等條件，評估了該技術的穩(wěn)健性。最終，通過盲測驗證和實際樣本檢測，進一步證明了該技術在檢測真實世界樣本中的有效性和可靠性。
表2 對25份商業(yè)樣品（C-1至C-30）和4份監(jiān)管樣品（R-1至R-4）的實際樣品評估。所開發(fā)的qPCR-HRM檢測結果經(jīng)VITEK 2細菌鑒定系統(tǒng)（美國生物梅里埃公司）驗證。
未來展望：食品安全檢測的新方向
雙重qPCR-HRMA技術的誕生，標志著食源性致病菌檢測從“單一、滯后”向“多重、即時”時代的跨越。隨著全球食品安全標準的日益嚴格，這類兼具高效性與經(jīng)濟性的分子檢測技術，將成為食品生產(chǎn)、加工、監(jiān)管各環(huán)節(jié)的“標配”工具，為消費者餐桌筑起更堅實的安全防線。正如研究團隊所言，該技術不僅是實驗室的創(chuàng)新成果，更是“推動全球食品供應鏈微生物風險管理的重要一步”。
參考文獻：Ajay G, Vishnuraj M R, Kumar N A, et al. A novel duplex qPCR-HRMA technique for simultaneous detection of Listeria monocytogenes and Salmonella typhimurium in meat products[J]. Food Chemistry, 2025, 474: 143245.
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~蔡偉程。
