近日，印度國家肉類研究所的一項(xiàng)新研究帶來新的曙光，他們成功開發(fā)了一種新型雙鏈qPCR-HRMA技術(shù)，能在短短3小時(shí)內(nèi)同時(shí)檢測出肉類中的這兩種致病菌，為食品安全檢測提供了更快、更準(zhǔn)、更高效的解決方案。

背景知識

李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌是肉類食品中最常見且危害極大的兩種致病菌。李斯特菌可引發(fā)嚴(yán)重的李斯特菌病，尤其對孕婦、兒童、老人及免疫力低下者有致命威脅；鼠傷寒沙門氏菌則每年導(dǎo)致全球1.5億人患病，平均6萬死亡。傳統(tǒng)的檢測方法不僅耗時(shí)幾天，還存在假陰性風(fēng)險(xiǎn)，難以滿足現(xiàn)代食品行業(yè)快速檢測的需求。

研究方法

研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)的雙鏈qPCR-HRMA技術(shù)，基于SYBR Green染料的實(shí)時(shí)PCR檢測方法，并結(jié)合高分辨率熔解曲線分析（HRMA）。通過精心設(shè)計(jì)的特異性引物，針對李斯特菌的prfA和鼠傷寒沙門氏菌的STM4497進(jìn)行檢測，分別產(chǎn)生148bp和119bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)過程優(yōu)化了退火溫度、引物濃度、循環(huán)次數(shù)等基本PCR參數(shù)，還確定了最佳的熔解速率，以確保兩種病原體的獨(dú)立、同時(shí)擴(kuò)增和清晰區(qū)分。

實(shí)驗(yàn)過程

細(xì)菌培養(yǎng)與DNA提取：從微生物技術(shù)研究所獲取參考菌株，進(jìn)行預(yù)富集和選擇性富集培養(yǎng)后，采用改良的熱冷裂解法提取DNA，確保DNA純度符合后續(xù)反應(yīng)要求。

引物設(shè)計(jì)與分析：利用PrimerQuest?工具設(shè)計(jì)引物，通過Primer-BLAST驗(yàn)證特異性，并使用OligoAnalyzer?等工具驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度差異，確保無交叉反應(yīng)。

建立雙鏈HRM實(shí)時(shí)PCR標(biāo)準(zhǔn)化方法：在優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系中，通過梯度溫度設(shè)置、調(diào)整引物濃度等，確定最佳退火溫度和引物組合，實(shí)現(xiàn)雙鏈擴(kuò)增。

熔解曲線分析條件優(yōu)化：通過調(diào)整升溫速率，確定最佳熔解速率，以獲得清晰的雙峰，實(shí)現(xiàn)兩種病原體的準(zhǔn)確區(qū)分。

關(guān)鍵結(jié)論

高靈敏度：反應(yīng)靈敏度達(dá)2pg DNA，相當(dāng)于檢測124個(gè)李斯特菌和100個(gè)鼠傷寒沙門氏菌拷貝數(shù)；方法靈敏度在肉樣中可達(dá)150 CFU/mL。

良好特異性：通過體外評估，引物對李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌DNA呈現(xiàn)特異性擴(kuò)增，無交叉反應(yīng)。

穩(wěn)定性強(qiáng)：在故意改變主混料濃度、使用不同 PCR 儀器情況下，仍能獲得可靠雙熔解曲線。

真實(shí)樣本檢測有效：對來自印度各地的25份商業(yè)食品樣本和4份監(jiān)管樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果與VITEK 2細(xì)菌鑒定系統(tǒng)匹配，準(zhǔn)確檢出陽性樣本。

研究意義

該技術(shù)僅需3小時(shí)即可完成檢測，極大縮短了檢測時(shí)間，提高了檢測效率，為監(jiān)管食品檢測和臨床調(diào)查提供了有力工具。同時(shí)，其標(biāo)準(zhǔn)化和驗(yàn)證過程遵循國際標(biāo)準(zhǔn)，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，有助于在全球食品安全供應(yīng)鏈中更好地檢測和管理食源性病原體，保障公眾健康。

參考文獻(xiàn)：1、Ajay, G et al. “A novel duplex qPCR-HRMA technique for simultaneous detection of Listeria monocytogenes and Salmonella typhimurium in meat products.” Food chemistry vol. 474 (2025): 143245. doi:10.1016/j.foodchem.2025.143245

來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~張穎。