1. 引言
金黃色葡萄球菌是一種常見的食源性病原體，需要快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。傳統(tǒng)的培養(yǎng)和PCR方法存在靈敏度低和耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)。近年來，基于核酸的熒光生物傳感器和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（如RCA）被開發(fā)，以提高檢測(cè)靈敏度和特異性。這些方法可以在復(fù)雜基質(zhì)中直接檢測(cè)金黃色葡萄球菌，簡(jiǎn)化了樣品處理步驟，滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。
本研究AAP-RCA分析基于一種特定的適體探針（AAP），該探針包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)用于識(shí)別目標(biāo)病原體的適體結(jié)構(gòu)域、一個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)鎖探針引物結(jié)構(gòu)域。在目標(biāo)病原體不存在時(shí)，AAP呈現(xiàn)非活性構(gòu)型，鎖探針引物域被退火，下游反應(yīng)無法啟動(dòng)。然而，當(dāng)金黃色葡萄球菌存在時(shí)，AAP的適體結(jié)構(gòu)域特異性識(shí)別并結(jié)合病原體，導(dǎo)致其發(fā)夾結(jié)構(gòu)展開并轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)。這種激活使得引物能夠與鎖探針新進(jìn)入的引物結(jié)合位點(diǎn)雜交。隨后，在T4 DNA連接酶、Phi29 DNA聚合酶和dNTPs的參與下，啟動(dòng)RCA反應(yīng)，產(chǎn)生具有重復(fù)g-四重體序列的長(zhǎng)線性串聯(lián)體。在與ThT結(jié)合后，g-四重鏈最終產(chǎn)生大大增強(qiáng)的熒光信號(hào)，用于測(cè)量金黃色葡萄球菌的存在。這種方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)金黃色葡萄球菌的直接、快速和敏感檢測(cè)。
方案1. 基于AAP-RCA直接檢測(cè)金黃色葡萄球菌的無標(biāo)簽策略示意圖
2. 結(jié)果與討論
可行性驗(yàn)證與分析
研究人員首先驗(yàn)證了AAP中掛鎖探針的引物是否被正確阻斷。凝膠電泳結(jié)果顯示，AAP在沒有金黃色葡萄球菌的情況下無法啟動(dòng)RCA過程，證明了AAP的穩(wěn)定性。熒光光譜法進(jìn)一步驗(yàn)證了AAP-RCA的性能：在無病原體存在時(shí)，熒光信號(hào)可忽略不計(jì)；而在有病原體存在時(shí)，熒光明顯增強(qiáng)，表明RCA反應(yīng)成功產(chǎn)生了g-四重鏈并增強(qiáng)了熒光信號(hào)。
研究人員首先驗(yàn)證了AAP中掛鎖探針的引物是否被正確阻斷。凝膠電泳結(jié)果顯示，AAP在沒有金黃色葡萄球菌的情況下無法啟動(dòng)RCA過程，證明了AAP的穩(wěn)定性。熒光光譜法進(jìn)一步驗(yàn)證了AAP-RCA的性能：在無病原體存在時(shí)，熒光信號(hào)可忽略不計(jì)；而在有病原體存在時(shí)，熒光明顯增強(qiáng)，表明RCA反應(yīng)成功產(chǎn)生了g-四重鏈并增強(qiáng)了熒光信號(hào)。
圖1. 可行性驗(yàn)證與分析
優(yōu)化AAP的莖長(zhǎng)
AAP被設(shè)計(jì)為在檢測(cè)到金黃色葡萄球菌時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)。為了優(yōu)化信號(hào)與背景噪聲比，需要調(diào)整AAP的莖長(zhǎng)以避免過度穩(wěn)定。通過測(cè)試不同長(zhǎng)度的AAP，發(fā)現(xiàn)莖長(zhǎng)為18個(gè)核苷酸（nt）的AAP表現(xiàn)出最高的信噪比（F/F0），適合用于AAP-RCA實(shí)驗(yàn)。這種長(zhǎng)度的AAP能夠有效減少非目標(biāo)引物的干擾，確保在目標(biāo)存在時(shí)實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)切換。
圖2. 金黃色葡萄球菌變構(gòu)示意圖及AAP鎖定堿基數(shù)量對(duì)金黃色葡萄球菌特異性結(jié)合的影響（S表示發(fā)夾探針）
選擇性和靈敏度實(shí)驗(yàn)
AAP-RCA方法在檢測(cè)金黃色葡萄球菌時(shí)表現(xiàn)出顯著的靈敏度和特異性。熒光強(qiáng)度與金黃色葡萄球菌濃度（103 ~ 4×105 CFU/mL）呈線性相關(guān)，檢出限為48 CFU/mL。該方法對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)信號(hào)遠(yuǎn)高于其他非靶菌，證明了其高特異性。這主要?dú)w因于AAP的強(qiáng)親和力和特異性識(shí)別能力。
圖3. 選擇性和靈敏度實(shí)驗(yàn)
真實(shí)樣品檢測(cè)及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
AAP-RCA方法在復(fù)雜生物標(biāo)本中檢測(cè)金黃色葡萄球菌的適用性得到了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法在自來水、牛奶、生菜和橙汁樣品中能夠準(zhǔn)確、可靠地檢測(cè)出金黃色葡萄球菌。熒光信號(hào)與金黃色葡萄球菌濃度呈線性相關(guān)，表明該方法在復(fù)雜基質(zhì)中具有良好的穩(wěn)定性和靈敏度。同時(shí)，AAP-RCA傳感器在4°C下表現(xiàn)出高穩(wěn)定性，9天內(nèi)信號(hào)衰減僅為8.8%。
圖4. 真實(shí)樣品檢測(cè)及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
3. 總結(jié)
本研究設(shè)計(jì)了一種基于AAP-RCA的方法，利用具有RCA擴(kuò)增的變構(gòu)適體探針進(jìn)行無標(biāo)記、敏感和特異性的病原體檢測(cè)。這種方法通過消除復(fù)雜的步驟，如細(xì)菌分離、核酸提取和洗滌，變得更加簡(jiǎn)單和成本效益高。AAP的高特異性與RCA的高擴(kuò)增效率結(jié)合，使得該策略對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)具有較高的靈敏度和選擇性。牛奶樣品中金黃色葡萄球菌的成功定量表明，AAP-RCA方法在食品和環(huán)境樣品中對(duì)危險(xiǎn)污染細(xì)菌的敏感鑒定方面具有令人鼓舞的前景。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于其簡(jiǎn)便性和高靈敏度，使其成為一種有前途的檢測(cè)工具。
論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.136674
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~占英。
