一、基因敲除Knock out

1）原理：是用含有一定已知序列的小DNA片段與受體細(xì)胞gene組中序列相同或相近的gene發(fā)生同源重組，整合至受體細(xì)胞gene組中并得到表達(dá)的一種外源DNA導(dǎo)入技術(shù)。

2）載體：
      ① CRISPR/Cas9載體：通過(guò)Cas9核酸酶和sgRNA靶xiang序列精que定位并靶向基因DNA序列,然后引入雙鏈斷裂點(diǎn)，完成gene敲除。
      ② TALENs載體：包含特異性核酸酶和nuclease binding domain，通過(guò)切割靶向基因DNA序列，完成敲除和編輯。
      ③ ZFNs載體：包含具有特異性的鋅指結(jié)構(gòu)域和核酸酶，通過(guò)切割靶向基因DNA序列，完成敲除和編輯。

3）載體構(gòu)建方法

① 設(shè)計(jì)和選擇：設(shè)計(jì)gene敲除的靶點(diǎn)，選擇CRISPR/Cas9等工具進(jìn)行編輯。
② 載體插入：將編輯過(guò)的靶點(diǎn)序列插入到特定的載體中。
③ 轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證：轉(zhuǎn)化編輯好的敲除載體至大腸桿菌中，進(jìn)行篩選鑒定，驗(yàn)證敲除效果。
④ 導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞：通過(guò)病毒載體、電穿孔等方法將敲除載體導(dǎo)入到目標(biāo)細(xì)胞中。

二、基因敲低

1）原理：gene敲低又稱gene敲降，是利用抑制劑來(lái)抑制gene的表達(dá)過(guò)程。有幾種不同的抑制方式可用于抑制gene的表達(dá)，其中主要的抑制方式有RNA干擾技術(shù)(RNAi)，CRISPR-Gas9技術(shù)以及gene轉(zhuǎn)染技術(shù)。這些技術(shù)使用不同的原理，但它們的共同點(diǎn)是都能夠發(fā)揮gene敲低的效果。

2）載體：
      ① siRNA載體：短干擾RNA。在3'端有兩個(gè)堿基的游離，可激活RNA干擾，通過(guò)與目標(biāo)mRNA互補(bǔ)結(jié)合序列，特異性地實(shí)現(xiàn)靶向mRNA降解。
      ② shRNA載體：短發(fā)夾RNA。一種siRNA前體，包括一個(gè)“莖”和一個(gè)“環(huán)”結(jié)構(gòu)，由RNA序列的短區(qū)域(這些區(qū)域形成“莖”)之間的堿基配對(duì)形成,由不形成堿基對(duì)的短序列(形成“環(huán)”)隔開(kāi)。
      ③ CRISPRi載體：包含CRISPRi靶向序列和轉(zhuǎn)錄抑制子，通過(guò)抑制靶向gene的轉(zhuǎn)錄水平實(shí)現(xiàn)gene敲低效果。

3）載體構(gòu)建方法

① 設(shè)計(jì)干擾序列：采用在線設(shè)計(jì)工具或經(jīng)驗(yàn)公式來(lái)計(jì)算。
② 合成和克?。?/strong>合成干擾序列的DNA或RNA小片段，并克隆到轉(zhuǎn)錄載體中，生成siRNA或shRNA表達(dá)載體。
③ 轉(zhuǎn)化和篩選：將siRNA或shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，進(jìn)行篩選鑒定。
④ 導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞：通過(guò)病毒等途徑將重組質(zhì)粒導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞中。

三、基因敲入

1）原理：利用gene同源重組，將外源的功能gene(gene組原先不存在、或已失活的gene)轉(zhuǎn)入細(xì)胞與gene組中的同源序列進(jìn)行同源重組，插入到gene組中，在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)的技術(shù)。

2）載體：
① sgRNA-Cas9載體：在KI基因編輯系統(tǒng)中像一把“剪刀”，可以精準(zhǔn)切開(kāi)雙鏈DNA，這把“剪刀”鋒利與否和精確度能直接影響Kl基因編輯系統(tǒng)的編輯效率。
② Donor DNA：一段高度同源的DNA模板。以Donor DNA為模板進(jìn)行修復(fù)，可以將目的片段定點(diǎn)引入gene組。

3）載體構(gòu)建方法

① 設(shè)計(jì)sgRNA及修復(fù)DNA模版：為了保證sgRNA沒(méi)有預(yù)ce的脫靶結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)人類AAVS1 AAVS1 Safe Harbor基因設(shè)計(jì)sgRNA，并進(jìn)行軟件分析。設(shè)計(jì)DNA修復(fù)模版，其兩側(cè)各有600bp的同源臂。
② 構(gòu)建sgRNA質(zhì)粒及修復(fù)DNA模板質(zhì)粒：選定sgRNA設(shè)計(jì)與CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cas9基因，將其克隆到pCas-Guide中來(lái)制備pCas-Guide-AAVS1；再將DNA修復(fù)模板插入含有RFP-嘌呤霉素的pAAVS1-RFP-DNR表達(dá)載體。
③ 將sgRNA-Cas9、修復(fù)DNA模版共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞：用lipofectmine2000轉(zhuǎn)染試劑將上述兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞。

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