在細胞培養(yǎng)的科研探索之路上，“鋪板為何總不均勻？”“消化傳代錯用培養(yǎng)基該怎么辦？”“緩沖液中酚紅、鈣鎂離子對細胞培養(yǎng)影響幾何？”

這些問題如同攔路虎，頻頻困擾著實驗人員。這些正是從細胞培養(yǎng)答疑群中精選出的三大熱點疑問，我們將深入剖析，為你揭開細胞培養(yǎng)難題的神秘面紗。

1、鋪板不均勻

Q：鋪板次日，細胞分布疏密不均，部分區(qū)域密度極高，而有的地方卻稀疏得很，這究竟是怎么回事？
A：遇到細胞鋪板后分布不均的狀況，需要抽絲剝繭、分類分析。常見的不均勻類型主要有三種：隨機分布不均、邊緣多中間少、邊緣少中間多。

先來看第一種 —— 隨機分布的不均勻。這種情況的 “罪魁禍首”，大概率是鋪板前細胞未能充分分散為單細胞懸液。一旦存在細胞團塊被接種到孔內(nèi)，經(jīng)過一夜生長，這些區(qū)域自然就會呈現(xiàn)出細胞過密的現(xiàn)象。

想要規(guī)避此類問題，可以從以下三個關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行優(yōu)化：

1. 精準把控細胞消化：部分細胞對胰蛋白酶極為敏感，消化時極易成片脫落。針對這類細胞，應(yīng)避免使用含 EDTA 的胰蛋白酶；也可通過稀釋胰酶濃度，或者加入胰酶后迅速吸走大部分，僅留少量在瓶內(nèi)消化，以此精準調(diào)控消化進程 。
2. 徹底吹散細胞：離心后的細胞重懸過程中，務(wù)必耐心細致地吹打，建議不少于 20 次。在細胞計數(shù)時，若發(fā)現(xiàn)仍有較多細胞團，必須繼續(xù)吹打直至細胞充分分散。
3. 及時鏡檢篩選：完成鋪板后，需即刻在顯微鏡下隨機選取多個視野觀察。一旦發(fā)現(xiàn)有細胞團，該孔細胞應(yīng)果斷舍棄，重新鋪板；若多個孔均存在此問題，則需更換新板重新操作。

第二種情況是邊緣多中間少，這種現(xiàn)象在孔面積較小的 96 孔板鋪板后尤為常見。

當(dāng)孔的面積特別小、例如96孔板這種，鋪板后就常見細胞邊緣多中間少的現(xiàn)象。究其原因，主要是孔內(nèi)液面形成了邊緣高、中間低的彎液面，導(dǎo)致表面張力分布不均。如下圖所示：

圖源：https://www.researchgate.net/figure/a-c-Solutions-of-the-three-dimensional-model-obtained-at-systematically-varied_fig3_350402772

此時，細胞在重力沉降的同時，還會受液體向孔邊緣流動的拽力影響，逐漸聚集到邊緣區(qū)域。

而造成這種結(jié)果的操作因素主要有兩點：一是孔內(nèi)液體體積不足，二是液體打出速度過快。

以 96 孔板為例，當(dāng)孔內(nèi)液體體積小于 100μL 時，彎液面現(xiàn)象顯著；而增加到 200μL 時，細胞分布不均的情況會得到極大改善。

圖源：https://www.bmglabtech.com/en/howto-notes/how-to-deal-with-path-length-and-meniscus-in-microplates/

此外，若使用移液器快速將細胞懸液全部沖擊到孔內(nèi)壁，會在局部形成高液面，加劇細胞邊緣聚集；

相反，以 50μL / 秒的速度緩慢將液體沿孔壁注入，可促使孔底液面均勻鋪展，有效降低彎液面的影響。

對于 24 孔板、6 孔板等較大孔板，雖然彎液面效應(yīng)相對較弱，但同樣要保證足夠的液體體積，24 孔板建議加入 1mL 液體，6 孔板則需 3mL。

第三種邊緣少中間多的情況，多發(fā)生在 6 孔板等培養(yǎng)面積較大的孔板上。

這主要是由于細胞懸液持續(xù)沖向孔底部與孔壁連接處的邊緣，就像水管對著墻角噴水，水流會反向涌動，使得細胞向打出方向的反方向流動。

由于孔內(nèi)面積較大，細胞無法直接到達另一端，最終大量聚集在中部區(qū)域。

改善方法與上述類似，可降低液體打出速度，讓細胞懸液沿孔壁緩緩流入，并增加液體打出的位置，選擇 2 - 3 個孔內(nèi)壁位置分次注入全部液體。

以上就是細胞鋪板不均勻的三種情況的對應(yīng)原因分析和解決辦法。不少同學(xué)還關(guān)心鋪板后的混勻操作，即如何搖晃孔板？

在這方面，關(guān)鍵在于把握搖晃力度與靜置時長。

對于 96 孔板，可在臺面上輕柔地畫 “十” 字或 “∞” 字，重復(fù) 2 - 3 輪；

而 24 孔板、6 孔板，因孔內(nèi)液體多、開口面積大，大幅度晃動易導(dǎo)致液體灑出，建議一手扶住孔板一側(cè)，另一手輕輕拍打?qū)?cè)邊緣 5 - 6 次。

無論何種規(guī)格的孔板，搖晃后都需靜置臺面至少 15 分鐘。然后再輕輕拿起來、慢慢走到培養(yǎng)箱旁放下，打開培養(yǎng)箱的門后，輕輕拿起培養(yǎng)板、小心放入，再輕輕關(guān)上門。

因為我們要讓細胞有足夠的時間沉到孔底，所以靜置的時間要足夠，不用擔(dān)心細胞在外面晾著會不會有問題，不會。我們拿起來孔板走動、放置這些動作都會造成液面波動，因此如果靜置時間不夠，細胞就會被液體流動帶偏了。

2、用錯培養(yǎng)基

Q：我的細胞一直用 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，消化后不慎使用 1640 培養(yǎng)基進行重懸和培養(yǎng)，這會對細胞有影響嗎？
A：對于這種臨時用錯培養(yǎng)基的情況，需要依據(jù)發(fā)現(xiàn)時間來分類處理：若在幾小時內(nèi)察覺錯誤，還有補救機會；若 2 - 3 天后才發(fā)現(xiàn)，則需根據(jù)細胞類型和狀態(tài)做進一步判斷。

市面上常見的 1640、DMEM、F12 等商品培養(yǎng)基，都是在 MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方上改良而來，其差異主要體現(xiàn)在對不同細胞生長的適配性，而非細胞毒性或損傷。

圖源：https://www.researchgate.net/figure/Composition-of-different-cell-culture-media-and-Krebs-Henseleit-buffer_tbl3_232224965

若在幾小時內(nèi)發(fā)現(xiàn)用錯培養(yǎng)基，可將細胞懸液吸出，通過離心去除錯誤培養(yǎng)基，重新更換正確培養(yǎng)基即可。

若是 2 - 3 天后或次日才發(fā)現(xiàn)，此時貼壁細胞大概率已完成貼壁，你可以根據(jù)細胞的類型、狀態(tài)來判斷下一步操作。

原代細胞對培養(yǎng)基成分較為敏感，錯用培養(yǎng)基可能導(dǎo)致細胞狀態(tài)變差，出現(xiàn)生長停滯甚至少量死亡，遇到這種情況建議直接棄用；而細胞系通常耐受性較強，一般不會產(chǎn)生嚴重影響，無需消化細胞，直接更換為正確培養(yǎng)基即可。

3、鈣鎂/酚紅

Q：在選擇 HBSS 緩沖液時，面對含鈣鎂離子 / 不含鈣鎂離子、含酚紅 / 不含酚紅等不同規(guī)格，該如何抉擇？
A：選擇 HBSS 緩沖液的關(guān)鍵在于匹配實驗需求，我們從離子成分和酚紅添加兩方面拆解分析。

一、Ca2?/Mg2?對實驗的影響與選擇

Ca2?和 Mg2?是細胞生理活動的 “幕后功臣”：Ca2?如同細胞與膠原、纖連蛋白等外基質(zhì)間的 “黏合劑”，能顯著提升細胞貼壁能力；Mg2?則作為 ATP 酶、DNA 聚合酶等核心酶的 “助手”，深度參與細胞代謝與信號傳導(dǎo)。

若需消化細胞：建議優(yōu)先使用不含鈣鎂離子的 HBSS。這是因為胰蛋白酶的活性會受鈣鎂離子濃度抑制 —— 想象胰酶是把 “剪刀”，而鈣鎂離子像無形的手束縛住它，導(dǎo)致剪碎細胞間連接的效率降低。此時用無鈣鎂 HBSS 洗滌，能為消化 “掃清障礙”。
若細胞貼壁不佳：可嘗試用含鈣鎂離子的 HBSS洗滌細胞。通過補充關(guān)鍵離子，增強細胞與基質(zhì)的黏附力，就像給細胞貼上更牢固的 “雙面膠”，改善貼壁狀態(tài)。

二、酚紅的作用與使用場景

酚紅是細胞培養(yǎng)中的 “pH 偵察兵”：當(dāng)環(huán)境 pH 為 7.4 時，它呈現(xiàn)標志性紅色；pH 下降（如細菌污染導(dǎo)致代謝酸積累），溶液迅速變黃；pH 上升則轉(zhuǎn)為紫色。這一特性使其成為判斷細胞狀態(tài)的 “可視化工具”。

圖源：https://www.researchgate.net/figure/Monitoring-pH-changes-in-cell-culture-by-phenol-red-Phenol-red-Phenolsulfonphthalein_fig1_368733721

如果細胞受到細菌污染，培養(yǎng)基就會很快變黃，其主要原因就是培養(yǎng)環(huán)境的pH下降得很多，造成酚紅變色了。因此，培養(yǎng)基的酚紅可以輔助我們判斷一些細胞狀態(tài)。

熒光或流式實驗：必須選用不含酚紅的 HBSS。酚紅的自發(fā)熒光如同 “干擾信號”，會掩蓋實驗觀察的真實熒光信號或影響流式細胞術(shù)的檢測精度。實驗前需用無酚紅緩沖液徹底洗滌細胞，確保結(jié)果不受干擾。

最后再補充一個知識點，就是胰蛋白酶是否含EDTA對細胞消化有什么影響呢？

EDTA通過結(jié)合Ca2?/Mg2?，破壞細胞間連接（如鈣黏蛋白依賴的細胞連接），輔助胰酶消化，當(dāng)面對一些難以消化的細胞時，可以嘗試使用含EDTA的胰蛋白酶。

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