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細胞培養(yǎng)又失敗了?保姆級細胞培養(yǎng)的詳細操作步驟來了!

發(fā)布時間:2023-03-21    瀏覽次數(shù):536

細胞寶寶很嬌貴,無菌操作最重要。那么我們?nèi)绾螠蕚錈o菌環(huán)境呢?

01. 操作器械滅菌>> 

  • 移液管吸頭高壓滅菌(或購買事先經(jīng)過滅菌的移液管吸頭)。

  • 70% 酒精對物品表面消毒。

02. 超凈工作臺或生物安全柜>> 

  • 將超凈工作臺窗扇關閉到合適位置,以保證空氣層流。

  • 凈化工作區(qū)禁止堆放雜物,干擾潔凈氣流流動。

  • 工作前消毒工作臺面,打開紫外燈消毒。工作結(jié)束后清理消毒臺面,并進行紫外消毒。

  • 具有潛在感染性的材料需在生物安全柜中處理,禁止使用超凈工作臺。

03. 試劑無菌>> 

所有培養(yǎng)基、添加劑和試劑必須無菌,防止細胞培養(yǎng)過程中微生物生長。如果某些試劑和添加劑未以無菌形式提供,則需要對其進行過濾除菌或高壓滅菌。此外,試劑需在無菌條件下配置和使用,以確保它們始終處于無菌狀態(tài)。

請記?。o菌操作貫穿細胞培養(yǎng)實驗始終!


接下來,我們要為細胞寶寶準備合適的食物。

細胞培養(yǎng)前,需要先查詢細胞系相關信息,以確定適合的培養(yǎng)基類型以及添加劑等。大多數(shù)細胞系可以使用MEM、 DMEM 培養(yǎng)基或RPMI等基礎培養(yǎng)基進行培養(yǎng),并要添加一定比例的胎牛血清(FBS)。


細胞寶寶還需要合適的環(huán)境,才能健康長大。

細胞培養(yǎng)需要控制細胞所處的溫度、pH、滲透壓、O2和CO2。

  • pH:大部分細胞在pH 7.4左右生長良好。

  • CO2:一般需要在專用的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),設置為5% CO2。

  • 溫度:大部分哺乳動物細胞培養(yǎng)溫度為37°C。禽類細胞在38.5°C生長最佳。昆蟲細胞最佳生長溫度是27°C。冷血動物細胞系可在15-26°C范圍內(nèi)培養(yǎng)。

  • 細胞培養(yǎng)容器:大多數(shù)細胞系在專用的細胞培養(yǎng)瓶上生長,不需要特殊的基質(zhì)等。但一些細胞,特別是原代細胞,需要在特殊的基質(zhì)(如膠原蛋白)上生長,以促進細胞貼壁、分化或生長。建議查閱相關文獻,詳細了解您正在培養(yǎng)的細胞。


細胞寶寶很孤獨,我們需要每天去呵護哦。

每天用顯微鏡觀察細胞,以監(jiān)測其健康狀況、生長速度和融合度(單層細胞覆蓋的表面積百分比)。貼壁細胞應主要附著在培養(yǎng)瓶底部,呈貼壁形態(tài)(取決于不同細胞系)。懸浮細胞應呈圓形形態(tài)。一般可以把細胞形態(tài)分為三種基本形態(tài):

細胞形態(tài)

含酚紅的培養(yǎng)基為粉紅色/橙色(培養(yǎng)基顏色會隨 CO 2 濃度發(fā)生變化)。含酚紅培養(yǎng)基呈淡黃色表示其pH 值降低呈酸性,通常與污染或細胞不健康有關。細胞成像實驗建議使用不含酚紅的培養(yǎng)基,避免干擾圖像采集。如果出現(xiàn)以下情況,請丟棄細胞:

  • 細胞大量脫落(貼壁細胞系)和/或看起來干癟并呈顆粒狀/深色。

  • 細胞處于停止生長狀態(tài)。


細胞寶寶需要一定的生活空間,太擁擠就需要搬家啦。

一般細胞融合度達到約 80%(即80% 的培養(yǎng)瓶表面被單層細胞覆蓋)時,即需要進行傳代培養(yǎng)。不建議細胞過度融合(達到100%)時傳代,因為這可能會影響細胞活性。

細胞傳代需要注意分板比/接種密度。不同的細胞系通常需要滿足特定的分板比/接種密度,務必查看所用細胞系的培養(yǎng)指南。生長較快的細胞可能需要高分板比(低接種密度),而生長緩慢的細胞可能需要低分板比(較高接種密度)。

如果細胞長時間無人看管(例如公共假日或周末),建議使用低于正常水平的分板比/接種密度。但是一些細胞,特別是原代細胞生長具有密度依賴性,過低的接種密度可能導致無法生長。

細胞分板比/接種密度需要通過對樣品中的細胞計數(shù)確定。細胞計數(shù)一般可使用血細胞計數(shù)板。

下面我再詳細說說細胞傳代的方法:

01. 貼壁細胞系>> 

貼壁細胞一般需要使用胰蛋白酶等消化液,但其可能會損傷細胞,還可能會誘使某些膜蛋白暫時內(nèi)化,因此設計實驗時應考慮到這一點。這時,可使用其他溫和消化試劑替代。以下是貼壁細胞傳代的一般步驟:

貼壁細胞傳代步驟

請注意:

  • PBS洗滌是為完全除去殘留的胎牛血清(FBS)、鈣和鎂等。必要時可多次洗滌(某些細胞系貼壁牢固,需多次沖洗才能徹底去除殘留 FBS),促進胰蛋白酶消化。

  • 胰蛋白酶用量以覆蓋培養(yǎng)瓶底部為宜,輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶,確保消化液與所有細胞接觸。

  • 將培養(yǎng)瓶放入 37 ℃ 培養(yǎng)箱中,更適合消化酶的消化。不同細胞消化時間不同,為避免因過度消化而嚴重破壞細胞,必須每隔幾分鐘進行一次檢查。

02. 半貼壁細胞系>> 

一些細胞系介于懸浮和貼壁細胞之間,針對松散貼壁細胞,可不使用消化液,而使用移液管溫柔吹打,使細胞分散。以下是半貼壁細胞傳代的一般步驟:

半貼壁細胞傳代步驟

03. 懸浮細胞系>> 

懸浮細胞傳代難度略低于貼壁細胞,無需經(jīng)消化處理。以下是懸浮細胞傳代的一般步驟:

懸浮細胞傳代步驟

請注意:

  • 一些懸浮細胞生長過程中可能結(jié)團,可添加 Pluronic PF68 等解離試劑使團塊分散。

  • 懸浮細胞多次傳代后,細胞碎片和代謝廢物會不斷積累,可將細胞懸液以 100 × g離心 5 - 10 分鐘,棄去上清液,將細胞沉淀重懸在新鮮培養(yǎng)基中。

小貼士

  • 細胞傳代需要注意細胞的傳代次數(shù)(細胞經(jīng)歷的傳代培養(yǎng)次數(shù))。培養(yǎng)中應記錄傳代次數(shù),細胞代次過高,可能會發(fā)生遺傳漂變或其它變異,影響您的實驗。

  • 低代次細胞,以及一些自己建立的特殊細胞系需要盡量多凍存幾管,以防細胞污染等情況造成您實驗中斷。

培養(yǎng)細胞是個精細活,要考慮到實驗的方方面面,才能得到理想狀態(tài)的細胞。最后一起看看細胞凍存、復蘇和細胞計數(shù)及存活測試!

01. 細胞凍存>> 

目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑,這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性,加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外,減少細胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少由冰晶形成的細胞損傷。

  • 10%的DMSO+90%胎牛血清。甘油一般用于菌種保存很少用于細胞凍存。

  • 取對數(shù)生長期的細胞,用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來,懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中。

  • 離心1000 rpm,5 min.

  • 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液,加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打使細胞均勻,計數(shù),調(diào)節(jié)凍存液中細胞的最終密度為5x10^6/ml~1x10^7/ml.

  • 在凍存管上標明細胞的名稱,凍存時間及操作者。

  • 凍存:標準的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/min;當溫度達到-25℃以下時,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃時,則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h,然后放入-70℃冰箱中過夜,取出凍存管,移入液氮容器內(nèi)。

02. 細胞復蘇>> 

  • 從液氮容器中取出凍存管,直接浸入37℃溫水中,并不時搖動令其盡快融化。

  • 從37℃水浴中取出凍存管,打開蓋子,用吸管吸出細胞懸液,加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液,混勻。

  • 離心,1000 rpm,5 min。

  • 棄去上層清液,加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞,計數(shù),調(diào)整細胞密度,接種培養(yǎng)瓶,37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

  • 次日更換一次培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。

03. 細胞計數(shù)和存活測試>> 

原理:

(1) 計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coultercounter粒子計數(shù)器自動計數(shù)。

(2) 血球計數(shù)盤一般有二個chambers,每個chamber中細刻9個1mm2大正方形,其中4個角落之正方形再細刻16個小格,深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后,每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時,計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目,乘以稀釋倍數(shù),再乘以104,即為每ml中之細胞數(shù)目。

(3) 存活測試之步驟為dyeexclusion,利用染料會滲入死細胞中而呈色,而活細胞因細胞膜完整,染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue染料,如果細胞不易吸收trypan blue,則用紅色之Erythrosin bluish。計算細胞活率:活細胞數(shù)/(活細胞數(shù)+死細胞數(shù))×100%。計數(shù)應在臺盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成,隨時間延長,部分活細胞也開始攝取染料;因為臺盼蘭對蛋白質(zhì)有很強的親和力,用不含血清的稀釋液,可以使染色計數(shù)更為準確。


材料:0.4%w/v trypan blue;Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球計數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip);計數(shù)器(counter);低倍倒立顯微鏡;粒子計數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白細胞稀釋液(4%乙酸溶液)。


步驟:

(1)取50μl細胞懸浮液與50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。

(2)取少許混合液(約15μl)自血球計數(shù)盤chamber上方凹槽加入,蓋上蓋玻片,于100倍倒立顯微鏡下觀察,活細胞不染色,死細胞則為藍色(或紅色-Erythrosin bluish)。

(3)計數(shù)四個大方格之細胞總數(shù),再除4,乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2,因與trypanblue等體積混合),最后乘以104,即為每ml中細胞懸浮液之細胞數(shù)。若細胞位于線上,只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。


注:4大格細胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4=細胞數(shù)/ml;每一大格的體積=2.5px×2.5px×0.25px=10-4ml

計數(shù)板計數(shù)時,最適濃度為5~10×105細胞/ml,此范圍外計數(shù)誤差偏大。高濃度細胞懸液,可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計數(shù)。

小貼士

  • 冷凍越慢越好,復蘇越快越好

  • 操作人員在接觸液氮罐時應戴防護面罩、防護手套,穿防護衣,防止凍存管或氣體爆裂對人體造成傷害。在存放液氮罐的房間中也應裝有檢測氣體濃度的報警裝置,防止人員暈厥的現(xiàn)象發(fā)生。大家在做實驗的時候一定要小心操作、注意安全。

  • 凍存細胞數(shù)量要足夠,一般最低要達到5x10^6/ml。濃度視情況而定。

  • 做好標記:培養(yǎng)瓶上應該用馬克筆做好標記,寫上細胞名稱、代數(shù)和凍存時間。

  • 對剛復蘇的細胞動作要輕柔,避免細胞破裂。

  • DMSO對大多數(shù)細胞不敏感,所以解凍之后不需要除去DMSO,解凍后頻繁換液會慢慢除去DMSO。部分對DMSO敏感的細胞需要除去DMSO。

  • 解凍后的細胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清,突然換不一樣的培養(yǎng)液和血清會造成細胞生長不良,甚至死亡。

下面這些凍存和復蘇遇到的坑請注意: 

1 復蘇時遇到凍存時挖的坑

實驗室偶爾也會發(fā)生這樣的情況:“靠,細胞要死了,趕緊凍掉,不能讓細胞死在我手里?!薄疤炷兀毎囵B(yǎng)液都這么黃了,趕緊凍掉?!薄皨屟?,細胞融合度都逼近100%了,趕緊凍掉。”“咦,細胞好像少了點,算了,就這樣吧?!比绻銖吞K的細胞就是上面這些人所留下來的,那就要格外注意了。

細胞老化融合度過高

解決方法:所謂知己知彼才能百戰(zhàn)不殆,在復蘇前,一定要先清楚地了解這份細胞的增殖能力。如果增殖能力不高,接種時就要增加細胞接種密度并添加5%~10%的血清。如果細胞本身數(shù)量就非常少,也可以不離心,直接接種培養(yǎng)(加入培養(yǎng)基的體積>5倍的凍存細胞體積)。復蘇后3天內(nèi)盡量少對細胞進行操作,延遲換液時間。

2 無孔不入的微生物

做實驗就像走鋼絲,稍不留神就會跌進充滿微生物的沼澤中不能自拔。

解決辦法:凍存時,一定要擰緊凍存管的蓋子,否則水浴復蘇的時候,水浴鍋中的水就會滲入到凍存管中去,造成細胞的污染并會使那些低免疫力的接受移植的患者產(chǎn)生嚴重的感染。

3 細胞非正?!皬吞K”

那是一個安靜的下午,大家都在專心地做著實驗,突然聽到有人大叫“這是誰的細胞,一直放在外面,都化了?!痹瓉韯偛磐氯〖毎臅r候,把整個凍存架都拿了出來,后來居然忘記再把它放回液氮罐中。而此時細胞們已經(jīng)無一幸免地 “融化了”。

解決辦法:馬上種瓶,千萬不要把這些細胞繼續(xù)放回液氮罐中凍存。此時細胞內(nèi)已經(jīng)有大量的冰晶形成,細胞膜已經(jīng)受到損傷,如果離心就會造成細胞膜完全破碎、細胞立即死亡的后果。所以切記不要離心,而應直接種瓶,也不要進行吹打,只輕輕搖晃。培養(yǎng)時加入10%的血清,種瓶后48h內(nèi)都不要對細胞進行操作。這是一個真實的案例,后來在大家的努力下,那些增殖能力本來就旺盛的細胞還是活了下來。

備注:本辦法也同樣適用于那些停電后造成超低溫冰箱升溫(一般升溫到-40℃時就要小心了)的情況。

4 拿錯了細胞,養(yǎng)了別人家的“孩子”

電視劇里抱錯孩子的狗血劇情也同樣會發(fā)生在實驗室中。學校的液氮罐基本上都是公用的,所以如果樣本標記不詳就會發(fā)生拿錯的情況。

解決辦法:每支凍存管上都應用凍存專用的記號筆詳細標記上細胞名稱、凍存時間、樣本批號等信息并將這些信息詳細記錄在冊。存放細胞時,最好規(guī)定每個人的存放位置,免得下次找細胞的時候非要把整個液氮罐翻個底朝天才找得到。復蘇拿取細胞時,也應在對應的存放位置處進行查找,找到對應的細胞后應核查記錄冊上的信息是否與凍存管上的細胞名稱、凍存時間、樣本批號一致。

5 安全第一,細胞第二

凡是和液氮接觸的操作,都應該注意安全。小編的同事Z就在一次打開液氮罐蓋子的時候被氣體沖擊了眼睛,導致眼睛當場流血,不過后來經(jīng)過醫(yī)治已經(jīng)沒有什么大礙了。還有小編的同事L在前單位工作時有一次在樣本保存室里突然暈倒了(估計是液氮罐漏氣所致)。

解決辦法:操作人員在接觸液氮罐時應戴防護面罩、防護手套,穿防護衣,防止凍存管或氣體爆裂對人體造成傷害。在存放液氮罐的房間中也應裝有檢測氣體濃度的報警裝置,防止人員暈厥的現(xiàn)象發(fā)生。大家在做實驗的時候一定要小心操作、注意安全。

6 如何讓凍存的組織滿血復活

很多時候我們都會遇到組織復蘇培養(yǎng)的成功率低、長勢慢的情況,這到底是哪里出錯了呢?

組織凍存怎么解

解決辦法:
(1)組織要剪得足夠?。?br />(2)程序降溫盒不要立馬放入-80℃冰箱中,應先置于4℃冰箱內(nèi)15min~30min;
(3)凍存液的體積應至少是組織體積的2~3倍;
(4)組織復蘇后進行培養(yǎng)時,應在培養(yǎng)基中加入5%~10%的血清。

7 復蘇后,細胞不見起色就扔掉?!

復蘇2~3天后,認為細胞沒有明顯增殖就扔掉細胞,但其實有些細胞需要復蘇一周后才會發(fā)生明顯的變化。

細胞復蘇無起色

解決辦法:如果復蘇培養(yǎng)3天后細胞仍不見增殖,先不要著急換液。試著補加血清、細胞因子,等一周后再看細胞增殖情況再定。

8 心急凍不了好細胞

凍存時,不要將細胞放入剛剛從-80℃冰箱中取出的程序降溫盒內(nèi)(此時盒內(nèi)的異丙醇還是凍住的)。這樣會導致細胞在一開始的時候就進入低溫狀態(tài),影響細胞復蘇后的存活率。

解決辦法:將程序降溫盒提前拿至室溫中,使細胞可以從室溫降至-80℃。

常規(guī)的程序降溫盒中是填充了異丙醇的,所以能夠以每分鐘一度的速度進行降溫。但是異丙醇屬于有毒溶劑,又容易揮發(fā),長期使用不但會對環(huán)境造成污染也對實驗人員的安全有不利影響。推薦一款新的細胞程序降溫盒,不需要填充異丙醇就可以正常工作,而且很容易打開蓋子,方便拿取。

轉(zhuǎn)自:abcam、 中洪博元醫(yī)學實驗幫、解螺旋
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