一、微生物菌種保藏的意義 

       菌種是從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，診斷制品的制備，菌苗的生產(chǎn)、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗(yàn)及藥品微生物檢驗(yàn)等都有一套完整的菌種.微生物具有生命活力，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此菌種保藏是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)工作，是微生物學(xué)基礎(chǔ)工作的一項(xiàng)重要內(nèi)容，也是藥品微生物工作中的一項(xiàng)常用技術(shù)。 

       如藥品中的控制菌檢查使用的陽性對(duì)照菌須防止因多次傳代而使陽性對(duì)照菌的典型生物學(xué)特征發(fā)生變化及菌株的死亡，保證達(dá)到菌種長(zhǎng)期正確的形態(tài)； 

       如藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)過程中，檢出的可疑致病菌須妥善保藏，以達(dá)到進(jìn)一步鑒定的目的，保證用藥安全。

二、微生物菌種代號(hào)的意義

國內(nèi)藥品微生物檢驗(yàn)所用的菌種代號(hào)是

CMCC（F）或 CMCC（B）

CMCC —— 中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心

B —— 代表細(xì)菌，

F ——代表真菌。

大腸桿菌 [CMCC (B) 44102]

乙型副傷寒沙門桿菌 [CMCC (B) 50094]

銅綠假單胞菌 [CMCC (B)10104]

金黃色葡萄球菌 [CMCC (B)26003]

生孢梭菌[CMCC(B)64941]

白色念珠菌[CMCC(F)98001]

三、常用微生物菌種保藏方法

  (一) 微生物菌種保藏的原理 

       根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，使細(xì)胞基本處于休眠狀態(tài)，生長(zhǎng)繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。因此，低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。

       選擇保藏方法時(shí)，首先應(yīng)考慮方法能否長(zhǎng)期地保持菌種原有的特性，同時(shí)也應(yīng)兼顧到方法的經(jīng)濟(jì)和簡(jiǎn)便。在實(shí)際工作中，往往多種條件同時(shí)使用,以提高保藏效果。 

 （二）微生物菌種保藏步驟 

① 挑選特征典型的純菌菌落；

② 確定保藏的合適菌體形態(tài)；

③ 選擇最適宜的保藏方法；

④ 定期對(duì)保藏菌種進(jìn)行檢查，觀察是否發(fā)生變化，若有變化，須改變保藏方法。保藏期滿應(yīng)及時(shí)進(jìn)行移種。

1. 瓊脂斜面低溫保存法

（1）方法：將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，待充分生長(zhǎng)后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙保好，為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長(zhǎng)保藏時(shí)間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3個(gè)月移種一次，繼續(xù)進(jìn)行保藏。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，一般可保藏半年 ~ 一年。有的甚至更長(zhǎng)時(shí)間。

（2）適用范圍：細(xì)菌、酵母菌、霉菌保藏。

  (3）特點(diǎn)：

 優(yōu)點(diǎn)是——簡(jiǎn)便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養(yǎng)基；對(duì)大多數(shù)微生物都適用。

 缺點(diǎn)是——保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。

（4）注意事項(xiàng)：

• 保藏的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。
•  保藏時(shí)，破傷風(fēng)桿菌可用庖肉培養(yǎng)基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。
• 必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動(dòng)或生霉，如有異常應(yīng)及時(shí)處理。
• 每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號(hào)、名稱逐一核對(duì)，確證培養(yǎng)基特征和純度無誤后再繼續(xù)保藏。
• 保藏菌種的培養(yǎng)基應(yīng)無糖，其他菌類含糖小于 2 %為宜，以免產(chǎn)酸過多，影響菌種存活。
• 銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。

2、液體石蠟保存法：

   本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理生化水平，并可防止水分蒸發(fā)，從而延長(zhǎng)菌種的保藏期。

（1）方法：

• 將菌種接種于斜面或穿刺于0.3~ 0.5 %瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好備用。取化學(xué)純的液體石蠟裝在試管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上紙，121℃高壓滅菌30min，取出置37℃溫箱或 110~ 170 ℃烤箱中 1 ~ 2 h 或干燥器內(nèi)除去液體石蠟中的水分。
• 將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好的菌種試管內(nèi)，液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端 1㎝為宜，將試管直立，放入4℃冰箱中保藏。
•  適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對(duì)細(xì)菌保藏效果較差。

（2）液體石蠟對(duì)各類菌種保藏效果

（3）特點(diǎn) 本方法簡(jiǎn)便易行，是實(shí)驗(yàn)室常用的一種保藏方法，該法主要使菌種與空氣隔絕。

（4）注意事項(xiàng)：

① 保藏時(shí)，用新鮮培養(yǎng)物接種，應(yīng)檢查純度和特征后，方可進(jìn)行保藏。

② 保藏過程中，需經(jīng)常觀察斜面是否干燥，如干燥， 需重新移種。

③ 使用菌種時(shí)，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新

鮮斜面上培 養(yǎng)，待長(zhǎng)出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上 即可使用。

④ 將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下

燒灼時(shí)，液體石蠟四濺，引起污染。

⑤ 液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基的高度要嚴(yán)格控制，如太多，會(huì)影響菌種交換氣體，使

保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面1 ㎝為宜。

⑥ 制備無菌液體石蠟時(shí)，每管裝量不能太多，否則分裝到菌種培養(yǎng)基中易造成污染。

四、試驗(yàn)用微生物菌種的培養(yǎng)傳代方法

程序：

• 檢定用標(biāo)準(zhǔn)菌種，由中國藥品生物檢定所提供，為冷凍干燥菌種。
• 菌種的復(fù)蘇與保存在專用無菌室或超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。
• 菌種傳代次數(shù)不應(yīng)超過5次。

1、 菌種的復(fù)蘇

• 把凍干菌種管、滅菌1ml 滴管、雙碟、鑷子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面數(shù)支，移入接種室或凈化工作臺(tái)。
• 先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕,再將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75% 乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點(diǎn)燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌滴管吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。
• 取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內(nèi)，另取1支滅菌滴管，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌攪動(dòng)促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至營養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內(nèi)，并將滴管及菌種管投入消毒液內(nèi)，將已接種的營養(yǎng)肉湯及營養(yǎng)瓊脂斜面置35~37℃培養(yǎng)22~24 h。
• 取出培養(yǎng)物，仔細(xì)觀察菌苔形態(tài)、有無雜菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落后，轉(zhuǎn)種3 代即可應(yīng)用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型，可進(jìn)行平板分離單菌落。

2、菌種的傳代與保存

方法

（1）： 菌斜面菌斜面（保存）

• 培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備，如斜面已無冷凝水者，不宜再使用。標(biāo)簽上著名菌名及接種日期。至冰箱取出的菌種斜面，應(yīng)在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺(tái)。
• 點(diǎn)燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠進(jìn)火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅30秒，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過3次。左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手用無名指、小指及掌部夾住棉塞，撥開棉塞，將接種環(huán)伸人管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮去少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰旁。
• 堵上棉塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面1支，照上述操作打開棉塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的低部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動(dòng)，使細(xì)菌劃在斜面的表面上。
• 取出接種棒，在火焰旁將培養(yǎng)基管棉塞堵上，然后將接種過細(xì)菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。
• 將已接種畢的細(xì)菌管置35~37℃培養(yǎng)22~24小時(shí)，霉菌管一般置20~25℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7日。取出后放人冰箱保存，一般 3個(gè)月轉(zhuǎn)種一次。

方法

（2）：菌斜面營養(yǎng)肉湯分離平板菌斜面

如果菌落形態(tài)不典型可純化，按下列方法傳代（分離菌落） ：

用接種環(huán)取上述菌管（斜面）菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5ml/支,已滅菌), 置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)后，再用接種環(huán)取培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液），接種于分離平板，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)，用接種針選典型菌落劃線于營養(yǎng)瓊脂斜面，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。一般同時(shí)接種幾支管，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養(yǎng)基中，其它用做工作菌種。

常用分離平板：

大腸埃希菌——EMB瓊脂平板

銅綠假單胞菌——溴化十六烷三甲銨瓊脂培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基

3 菌懸液的制備

取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入接種室或凈化工作臺(tái)，放置室溫后, 用接種環(huán)取菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5ml/支,已滅菌), 將已接種畢的細(xì)菌管置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)，取出備用。一般于冰箱中保存可用7天。

4 對(duì)照用菌液制備

取上述培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液）1ml，加到9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1 ml加到9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-2 ……以此類推，稀釋至含活菌數(shù)在 50 ~ 100 個(gè)。用平板計(jì)數(shù)。此稀釋菌液用于試驗(yàn)后加陽性對(duì)照，可在1天內(nèi)使用。

五、微生物菌種保管

• 菌種保管應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種安全。因工作變動(dòng)時(shí)，必須做好交接工作。
• 菌種應(yīng)有詳細(xì)登記本，包括名稱、分離日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能，并注意記錄使用、轉(zhuǎn)移及銷毀情況和原因。
• 各種菌種應(yīng)按規(guī)定時(shí)間定期移種。一般每移種3次后作一次全面鑒定。注意菌種有無污染和變異，如發(fā)現(xiàn)污染和變異時(shí)，應(yīng)及時(shí)更換。
•  購置菌種，應(yīng)有介紹信。全部保存菌種應(yīng)具備清單，并定期向部門負(fù)責(zé)人報(bào)告。