Hoechst 是一種可以穿透細(xì)胞膜的膜通透性熒光染料，在嵌入雙鏈 DNA 后釋放藍(lán)色熒光，故正常細(xì)胞和中早期凋亡細(xì)胞均可被 Hoechst 著色，正常細(xì)胞核 Hoechst 染色的形態(tài)呈圓形，淡藍(lán)色，內(nèi)有較深的藍(lán)色顆粒，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核由于濃集而呈亮藍(lán)色，或核呈分葉，碎片狀。

Hoechst 33258 常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，多用干活細(xì)胞染色，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

Hoechst 33342 活細(xì)胞和死細(xì)胞均可。Hoechst 33342 能透過胞膜完整的細(xì)胞嵌入細(xì)胞核 DNA 使之發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光。

凋亡的細(xì)胞核染色增強(qiáng)，熒光更為明亮，呈圓狀或固縮狀、團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)。非凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)熒光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征。二者形態(tài)迥然相異，很易區(qū)別判別。

hoechst 染色原理

Hoechst 33258 和 Hoechst 33342 均為非嵌人性熒光染料。它們?cè)诨罴?xì)胞中 DNA 聚 AT 序列富集區(qū)域的小溝處與 DNA 結(jié)合?；罴?xì)胞或固定細(xì)胞均可從低濃度溶液中攝取該染料。從而使細(xì)胞核著色。故又把此類染料稱為 DNA 探針。

Hoechst 33342 和 Hoechst 33258 均可溶于水并在水溶液中保持穩(wěn)定。Hoechsr-DNA 的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別 550 nm 和 460 nm。在熒光顯微鏡紫外光激發(fā)時(shí)，Hoechst-DNA 發(fā)出亮藍(lán)色熒光。

用途：觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞的凋亡鑒定。

hoechst 染色所用材料與儀器

普通潔凈蓋玻片、無菌超凈臺(tái)、4% 多聚甲醛、PBS緩沖液、細(xì)胞培養(yǎng)液、蓋玻片、細(xì)胞固定液、Hoechst 染色液、顯微鏡、離心管、離心機(jī)、抗熒光淬滅封片液。

hoechst 染色步驟

（1）離心收集細(xì)胞樣品于 1.5ml離心管內(nèi)，加入 0.5 ml 4% 多聚甲醛固定液，緩緩懸起細(xì)胞，固定 10 分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間（可 4 ℃ 過夜）。

（2）離心去固定液，用 PBS 洗三遍，每次 3 分鐘。

（3）最后一次離心后吸去大部分液體保留約 50 ml 液體，再緩緩懸起細(xì)胞，滴加至載玻片上，盡量使細(xì)胞分布均勻。

（4）晾干后，使細(xì)胞貼在載玻片上不易隨液體流動(dòng)。

（5）均勻滴上 0.5 ml Hoechst 染色液，染色 5 分鐘，用吸水紙從邊緣吸去液體，晾干。

（6）用 PBS 洗三遍，每次 3 分鐘。

（7）滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。

（8）熒光顯微鏡可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞。

試驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、過程需要無菌；

2、蓋玻片時(shí)小心，不能產(chǎn)生氣泡或者正反顛倒；

3、洗滌期間手動(dòng)晃動(dòng)；

4、為減緩熒光淬滅可以使用抗熒光淬滅封片液，建議染色后盡量當(dāng)天完成檢測(cè)；

5、對(duì)于懸浮細(xì)胞，至少加入待染色樣品體積 3 倍的染色液，并混勻，室溫放置 3～5 分鐘；

6、Hoechst 33342 對(duì)細(xì)胞的毒性作用更小一些，因此一般 Hoechst 33258 用于細(xì)胞固定后再染色，而 Hoechst 33342 則可以對(duì)活細(xì)胞直接進(jìn)行染色。

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