研究背景
先進治療藥物（ATMPs）是一類創(chuàng)新的治療方法，用于治療罕見、嚴重和慢性疾病，特別是在傳統(tǒng)療法效果不足的情況下。ATMPs主要包括基于體細胞、干細胞、基因和組織工程的療法，旨在修復受損細胞或組織并治療退行性疾病。然而，ATMPs的生產涉及體外細胞培養(yǎng)，容易受到微生物污染。由于目前的細胞治療產品（CTPs）生產工藝無法進行終端滅菌，因此必須在輸注前進行無菌檢測以確保安全性。目前，行業(yè)普遍采用的無菌檢測方法為USP<71>方法（美國藥典第71章記錄的無菌檢測法），但該方法最初針對大批量藥品設計，不完全適用于ATMPs。此外，該方法依賴14天的培養(yǎng)和肉眼觀察濁度來判斷污染，其CTPs本身的培養(yǎng)基成分可能導致假陽性結果，且操作繁瑣、易引入污染。
近日，新加坡-麻省理工學院研究聯(lián)盟、新加坡A*SRL實驗室、新加坡國立大學、美國麻省理工學院的聯(lián)合研究團隊提出了一種基于機器學習輔助的紫外吸收光譜法，用于實時、無標記、非侵入式的微生物污染檢測。該方法利用間充質干細胞（MSC）培養(yǎng)物的光譜數(shù)據(jù)，訓練單類支持向量機（SVM）模型，通過異常檢測識別污染。實驗證明，該方法可在21小時內檢測到低至10 CFU的微生物污染，并在不同供體MSC中驗證了其穩(wěn)健性。這一技術有望整合到CTP生產過程中，實現(xiàn)實時、低成本的無菌監(jiān)測。
研究主要內容及結果
（1）使用機器學習輔助紫外吸收光譜檢測大腸桿菌的時間探究（圖1）：為驗證所提出方法的靈敏度，本研究考察了污染物檢測所需時間。初步實驗選用在富含營養(yǎng)的培養(yǎng)基（如DMEM培養(yǎng)基）中生長迅速的大腸桿菌K-12（ATCC 25404）。需注意的是，臍帶血來源的細胞治療產品中偶見大腸桿菌污染，后續(xù)實驗將擴展至更多微生物。研究將10 CFU的大腸桿菌接種至單一供體（供體A）的MSC培養(yǎng)物中，并在9至24小時間隔3小時采集三次上清液樣本。所有樣本（含陰陽性對照）均通過光譜儀三重測量，并利用基于供體A無菌PBS樣本訓練的單類SVM模型評估吸光度數(shù)據(jù)。模型在約21小時后成功檢測到10 CFU大腸桿菌污染，此時所有陰性對照被判定為無菌，陽性對照均為污染（100%真陽性和真陰性）。總檢測時間（含樣本提取、光譜測量和SVM分析）約為21.5小時，證實該方法可檢測低菌量（10 CFU）污染。通過扣除陰性對照（PBS處理的供體AMSC上清）吸光度均值，對比陽性對照（含1000 CFU大腸桿菌的DMEM）和測試樣本（10 CFU大腸桿菌）的吸光度變化。結果表明高菌量陽性對照的吸光度增長更顯著，而10 CFU樣本的變化在18小時后明顯，導致21小時被判定為污染。
圖1 大腸桿菌加標樣本在9小時至24小時時間區(qū)間內每隔3小時測得的平均吸光度光譜結果圖。a.陽性對照（1000 CFU大腸桿菌加標樣本，橙色曲線）扣除同時間點陰性對照樣本平均吸光度后的光譜變化?？捎^察到9小時至18小時期間吸光度快速上升，之后增幅趨于平緩。b.低菌量組（10 CFU大腸桿菌加標樣本，深藍色曲線）扣除同時間點陰性對照后的光譜變化。21小時和24小時時間點的吸光度上升尤為顯著。
（2）檢測其他微生物污染物：為驗證該方法的適用性，研究對USP<71>標準菌株（如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌等）及緩慢生長的微生物（如痤瘡丙酸桿菌）進行了盲法測試。結果表明該機器學習輔助紫外光譜法可廣譜檢測多種微生物污染（包括快/慢生長菌），靈敏度達10 CFU，且不受培養(yǎng)代次干擾。結合LC-MS揭示的煙酸代謝差異，證實其通過光譜特征識別污染的可行性，為細胞治療產品的無菌監(jiān)測提供了高效、通用的解決方案。
（3）機器學習輔助紫外吸收光譜法的穩(wěn)定性研究（圖2和圖3）。供體間差異（如組織來源、年齡、性別和生理狀態(tài)）是影響MSC療效的關鍵因素。為驗證所開發(fā)模型的普適性，研究測試了6種商業(yè)供體（B-G）的樣本。通過紫外光譜分析發(fā)現(xiàn)，供體A和B的無菌樣本預測準確率最高（分別為81.2%和65.6%），因此選擇它們訓練SVM模型。方法對7種微生物的污染檢測限仍為10 CFU，真陽性率達92.7%（最低準確率為枯草芽孢桿菌樣本）。真陰性率為77.7%，其中14個假陽性樣本中10例來自供體F。LC-MS分析表明，供體F無菌樣本的煙酸（NA）基線濃度（>2×10? counts）顯著高于訓練集供體A/B（1.6×10? counts），導致模型誤判?？偟膩碚f，該方法對多數(shù)供體具有良好適用性，但需優(yōu)化以降低供體間代謝差異（如NA濃度）的干擾，進一步提升特異性。
圖2 混淆矩陣與分類報告顯示：基于供體A和B的PBS加標樣本訓練的SVM模型，在評估6個商業(yè)MSC供體（B-G）418份測試樣本無菌狀態(tài)時，取得92.7%的真陽性準確率與77.7%的真陰性準確率。
圖3 基于供體A和B樣本訓練的SVM模型對不同微生物在10 CFU濃度下的檢測限與準確率
研究結論
本研究開發(fā)了一種基于紫外吸收光譜和機器學習的新型快速無菌檢測技術，能夠以簡單、經濟和非侵入的方式在21小時內檢測低至10 CFU的多種微生物污染（平均真陽性率92%）。該方法通過煙酸/煙酰胺代謝物的光譜差異識別污染，無需復雜培養(yǎng)步驟，且已驗證其在跨供體MSCs中的適用性。盡管存在需擴展微生物檢測范圍、優(yōu)化供體普適性等局限性，但其快速（<30分鐘）、低樣本需求（<1 mL）和自動化兼容性優(yōu)勢，使其有望整合到細胞治療產品（CTP）生產流程中，作為實時污染監(jiān)測的初步篩查工具。未來通過對接自動化采樣系統(tǒng)，可進一步實現(xiàn)連續(xù)在線監(jiān)測，提升CTP生產的安全性控制效率。
論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41598-024-83114-y
來源：微生物安全與健康網，作者~馮燕梅。
