微生物燃料電池（MFC）傳感器是一種自再生、通用性強的平臺，可開發(fā)低成本、易用的分析設(shè)備，替代繁瑣且昂貴的傳統(tǒng)技術(shù)。MFC傳感器利用電活性細菌（EAB）通過細菌與電極之間的細胞外電子轉(zhuǎn)移EET將分析物轉(zhuǎn)化為電信號，多以陽極模式運行，并通過干擾EAB代謝實現(xiàn)檢測，但受限于代謝響應(yīng)速度和底物依賴性，難以應(yīng)用于低有機物環(huán)境。而反向EET可使細菌從陰極獲取電子進行還原反應(yīng)，效率高且與代謝無關(guān)?；诖擞醒芯繉腋AB細胞作為傳感元件，構(gòu)建了全細胞生物陰極傳感器，靈敏度高并簡化了制備過程。當(dāng)目標(biāo)分析物可被特定酶感知時，該傳感器還具有高選擇性。但反向EET驅(qū)動的生物陰極反應(yīng)通常在較低電極電位下進行（低于-0.56 V，相對于SCE），直接用MFC陽極驅(qū)動在熱力學(xué)上不利，而采用三電極系統(tǒng)則與自供能特性相沖突。

將光電極與MFC集成已被驗證可以顯著提高MFC的性能，光陽極有望驅(qū)動生物陰極傳感器，但與酶傳感器相比，全細胞生物陰極傳感器的電子傳輸路徑更為復(fù)雜，可能涉及一系列具有不同氧化還原電位的電子傳輸?shù)鞍?。并且由于生物陰極在相對較低的電極電位下運行，必須避免諸如氧氣還原和氫氣生成等副反應(yīng)。因此，制備一個具有適當(dāng)光電化學(xué)特性的光陽極以匹配生物陰極的動力學(xué)至關(guān)重要，這為開發(fā)自供能、高效的全細胞生物陰極傳感器奠定了基礎(chǔ)。在本研究中，顧崢等人首次開發(fā)了一種用于硝酸鹽檢測的自驅(qū)動全細胞生物陰極傳感器。

1、研究思路與方法：

A. 生物陰極的構(gòu)建
使用缺乏表達亞硝酸鹽還原酶NrfA能力的希瓦氏菌（Shewanella oneidensis MR-1）作為生物催化劑，并補充乳酸鈉作為電子供體加速硝酸鹽的消耗并顯著縮短檢測時間。還通過添加1-羥基苯并菲（1-OH phenazine）、中性紅（NR）、核黃素（RF）等物質(zhì)作為可溶性電子穿梭體，優(yōu)化生物陰極的性能。

B. In?O?/In?S?光陽極的制備與表征
商業(yè)FTO電極乙醇和去離子水清洗后放入聚四氟乙烯襯里的不銹鋼高壓釜中，加入前驅(qū)液（含In(NO?)?和NaNO?），經(jīng)加熱、沖洗、干燥和煅燒后得到In?O?修飾的FTO電極（In?O?@FTO）。隨后使用L-半胱氨酸作為硫源對In?O?@FTO進行硫化處理，制備In?O?/In?S?光陽極。最后使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡、X射線衍射和X射線光電子能譜、紫外-可見漫反射光譜（UV–vis DRS）以及線性掃描伏安法（LSV）觀察所制備光陽極的形貌、晶體結(jié)構(gòu)和組成、光吸收能力、光電化學(xué)特性。

C. 生物陰極傳感器的組裝與測試
將光陽極與生物陰極通過短路連接，構(gòu)建了一個自供能的生物傳感器。陽極液為0.1 M Na?SO?，陰極液為含有M9培養(yǎng)基、18 mM乳酸鈉和2 μM 1-羥基苯并菲的細菌懸浮液。通過光照驅(qū)動光陽極產(chǎn)生電流，進而為生物陰極提供電子，實現(xiàn)對硝酸鹽的還原檢測。實驗中通過向生物陰極室中添加不同濃度的硝酸鹽溶液，記錄電流響應(yīng)，評估傳感器的性能。

2、研究結(jié)果：

A. 生物陰極對硝酸鹽還原的動力學(xué)特性：

圖 1 希瓦氏菌（Shewanella oneidensis MR-1）細胞對硝酸鹽還原的循環(huán)伏安特性曲線

本研究構(gòu)建了一個由碳布電極和細菌懸浮液組成的生物陰極，并在10 mM硝酸鹽存在下進行循環(huán)伏安（CV）分析，以促進細胞外電子傳遞（EET）。如圖1所示，僅在細菌細胞存在時無法區(qū)分明顯的氧化還原峰，但當(dāng)加入硝酸鹽后，出現(xiàn)了還原電流，表明即使懸浮的細菌細胞也能進行硝酸鹽還原的反向電子傳遞。加入可溶性電子穿梭體后，觀察到可逆的氧化還原峰，其表觀標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位分別為-0.613 V（中性紅，NR）、-0.492 V（核黃素，RF）和-0.472 V（1-羥基苯并菲，POH）。如預(yù)期所示，當(dāng)向生物陰極中加入硝酸鹽（nitrate）時，可逆峰轉(zhuǎn)變?yōu)镾型，陰極電流顯著增加。這些結(jié)果證實了電子穿梭體有效地增強了硝酸鹽還原速率并降低了過電位。與NR和RF相比，POH介導(dǎo)的硝酸鹽還原顯示出更正的起始電位，并且還原電流高于NR。更重要的是，這一起始電位非常接近希瓦氏菌中硝酸鹽還原酶的熱力學(xué)限制。因此，POH被選為后續(xù)研究的最佳電子穿梭體。

B. 光陽極的性能：

圖 2 光驅(qū)動生物陰極傳感器的光電化學(xué)特性及對硝酸鹽的響應(yīng)分析

通過UV–vis DRS測量光陽極的光吸收能力，發(fā)現(xiàn)In?O?/In?S?光陽極在可見光區(qū)域具有廣泛吸收范圍，最大吸收在500 nm以下。如圖2a，LSV分析表明，In?O?/In?S?-3光陽極表現(xiàn)出較低的起始電位（-0.9 V）和較大的陽極電流（277 μA@-0.6 V），優(yōu)于In?O?/In?S?-5。此外，In?O?/In?S?-3在無光照時僅產(chǎn)生背景電流，表明其光電化學(xué)特性顯著，可為生物陰極提供動力。基于此，通過短路連接In?O?/In?S?-3光陽極和生物陰極，構(gòu)建了雙室光驅(qū)動生物陰極還原系統(tǒng)。如圖2b，在有光照但無硝酸鹽時，背景電流迅速衰減至<1 μA，表明副反應(yīng)可忽略；加入10 μM硝酸鹽后，電流響應(yīng)迅速上升后逐漸衰減，表明反向電子傳遞成功建立且硝酸鹽被消耗。進一步實驗表明，加入更高濃度硝酸鹽（30 μM和50 μM）時，電流響應(yīng)趨勢類似，但加入10 μM硝酸鹽時的峰值電流更高。

如圖2c，在三電極體系中，生物陰極對硝酸鹽的安培響應(yīng)趨勢與光驅(qū)動生物陰極相似，但峰值電流略有差異。如圖2d，研究者通過另一個電化學(xué)工作站同時測量了光驅(qū)動生物陰極還原過程中生物陰極的電極電位，發(fā)現(xiàn)生物陰極電位對硝酸鹽添加表現(xiàn)出動態(tài)響應(yīng)。無硝酸鹽時穩(wěn)定在約-0.84 V，加入硝酸鹽后電位正向移動。這表明光陽極供電負擔(dān)低，硝酸鹽還原加速導(dǎo)致光陽極過電位增大，電極電位正向移動。因此，整個系統(tǒng)的動力學(xué)瓶頸在于光陽極，生物陰極在一定濃度范圍內(nèi)可高效還原硝酸鹽，為定量分析奠定了基礎(chǔ)。

C. 傳感器的開發(fā)：

圖 3 光驅(qū)動生物陰極傳感器對硝酸鹽劑量的電流響應(yīng)

生物傳感器由LED驅(qū)動的In?O?/In?S?-3光陽極、MR-1懸浮液生物陰極和碳布電極組成。在無硝酸鹽時記錄背景電流，穩(wěn)定后注入硝酸鹽水樣并記錄電流變化。如圖3a，低至0.1 μM的硝酸鹽即可引起即時電流響應(yīng)，且單次檢測僅需幾十到幾百秒，遠快于傳統(tǒng)生物陽極傳感器（需近1小時）。

如圖3b和3c所示，隨著硝酸鹽濃度增加，峰值電流在0.1–20 μM范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，靈敏度為5.32 μA μM?1，檢測限為0.028 μM。當(dāng)濃度超過50 μM時，峰值電流趨于飽和（150 μM時為178 μA），這可能是由于光陽極和生物陰極的動力學(xué)限制。與傳統(tǒng)方法相比，該傳感器具有更高的靈敏度和更低的檢測限。

D. 生物傳感器的檢測性能

在應(yīng)用于實際樣品測試之前，本研究對所開發(fā)的生物傳感器的選擇性、可重復(fù)使用性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性進行探究。

a) 選擇性：研究發(fā)現(xiàn)在高濃度（1 mM）的常見陰離子（氯離子、硫酸根離子、碳酸根離子）存在下，電流響應(yīng)變化小于1 μA，表明傳感器對硝酸鹽具有良好的選擇性。即使在亞硝酸鹽存在時，通過基因敲除亞硝酸鹽還原酶（ΔnrfA），傳感器對硝酸鹽的選擇性顯著提高，響應(yīng)電流主要反映硝酸鹽的濃度。

b) 可重復(fù)使用性：連續(xù)10次測量10 μM硝酸鹽水樣時，電流響應(yīng)略有衰減，可能是由于光陽極的部分光腐蝕。在4°C下儲存光陽極30天，未觀察到電流響應(yīng)衰減，表明光陽極具有良好的儲存穩(wěn)定性。

c) 準(zhǔn)確性和重復(fù)性：通過向水樣中添加1–15 μM硝酸鹽進行測試，回收率為91.5%–111%，變異系數(shù)（CV）為0.7%–8.8%，表明傳感器具有高準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

3、實際應(yīng)用

將生物傳感器應(yīng)用于生物反應(yīng)器水樣的檢測，結(jié)果與傳統(tǒng)比色法一致（偏差小于10%），表明該傳感器具有良好的抗干擾能力和實際應(yīng)用潛力。

4、創(chuàng)新點

1、開發(fā)了一種用于硝酸鹽檢測的光驅(qū)動全細胞生物陰極傳感器。
2、In?O?/In?S?光陽極高效驅(qū)動生物陰極，并與其動力學(xué)特性相匹配。
3、生物陰極電位能夠動態(tài)響應(yīng)不同劑量的硝酸鹽。
4、實現(xiàn)了0.1–20 μM的線性檢測范圍和0.028 μM的檢測限。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.136761

文章來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~梁冬雪。