研究背景

在疾病診斷和食品安全領(lǐng)域，對生物分子的高靈敏度檢測是一個(gè)重要需求。大規(guī)模傳染病的頻繁發(fā)生使得盡早診斷出患有傳染病的患者變得至關(guān)重要，以便進(jìn)行臨床觀察和控制，防止傳染病的傳播。

由于體內(nèi)許多蛋白質(zhì)分子的濃度非常低，因此在低豐度蛋白的檢測中，信號放大是一個(gè)關(guān)鍵問題。富集低豐度蛋白大大增加了識別的可能性，并允許有效識別不易被檢測到的蛋白質(zhì)。分離和富集技術(shù)可以提高靈敏度、選擇性和準(zhǔn)確性。用抗體或寡核苷酸功能化的磁性納米顆粒已用于樣品中目標(biāo)的預(yù)處理分離和富集?；谶@些背景，文章提出了一種新的方法，通過結(jié)合毛細(xì)管磁分離富集和激光誘導(dǎo)熒光檢測技術(shù)，來實(shí)現(xiàn)對生物分子的快速、高靈敏度檢測。這種方法旨在簡化操作步驟，實(shí)現(xiàn)快速分離、富集，并提高單位體積內(nèi)目標(biāo)分子的濃度，從而提高檢測的靈敏度和效率。

設(shè)計(jì)毛細(xì)管磁分離-DNA設(shè)備

描述了使用毛細(xì)管作為分離通道，并利用流體拖曳力作為驅(qū)動(dòng)力來實(shí)現(xiàn)生物分子的分離和富集。利用兩種DNA探針和目標(biāo)DNA形成的三明治結(jié)構(gòu)與磁性納米粒子結(jié)合，通過毛細(xì)管注射泵將混合溶液注入毛細(xì)管中，三明治結(jié)構(gòu)被磁場力固定，并通過激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測器檢測，實(shí)現(xiàn)了樣本的在線分離、富集和檢測。

Fig. 1. Scheme of capillary magnetic separation-DNA equipment: (A) The sample pretreatment. (B) The detection process.

設(shè)備對DNA檢測的性能

研究了牛血清白蛋白(BSA)的濃度對熒光峰面積的影響，并確定了BSA最佳濃度為0.8 mg/mL。研究了不同流速對熒光峰形狀和面積的影響，確定了最佳流速為150 μL/min。探討了磁性納米粒子的最佳濃度和cDNA的濃度對檢測性能的影響，確定了MNPs和cDNA的最佳濃度分別為0.5 mg/mL、50 nmol/L。在最佳條件下，利用該方法對不同濃度的tDNA進(jìn)行了定量檢測，檢測限為2.7 fmol/L。

Fig. 2. (A) Effect of BSA concentration on fluorescent peak area. (B) The chromatogram of different velocity. (C) The fluorescence peak area of different velocity. (D) The influence of different concentrations of MNPs. (E) Areas of fluorescence peaks corresponding to different concentrations of cDNA. (F) Calibration curve of tDNA concentration vs fluorescence peak area. (G) The detection of tDNA in 900 μL. (H) The fluorescence peak area of different DNA sequences.

凝血酶檢測的可行性和分析性能

使用考馬斯亮藍(lán)法驗(yàn)證了cApt-29-MNPs成功捕獲凝血酶的能力。研究了不同濃度的K⁺和Mg²⁺對凝血酶檢測的影響，確定了Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)作為樣品溶劑和分離緩沖液。確定了凝血酶與寡核苷酸的最佳孵育時(shí)間和溫度，以及信號探針sApt-15的最佳濃度。在最佳條件下，該方法對不同濃度的凝血酶進(jìn)行了檢測，檢測限為0.57 nmol/L。

Fig. 3. (A) Effect of the concentration of K⁺ and Mg²⁺. (B) Optimization of incubation time of thrombin with aptamer. (C) Fluorescence peak area of thrombin in 4°C, 22°C (room temperature) and 37°C. (D) Effect of the concentration of sApt-15. Calibration curves of different concentration of thrombin (E) 90 μL (F) 900 μL.

設(shè)備對S. aureus檢測的分析性能

通過透射電子顯微鏡(TEM)圖像證實(shí)了cApt-62-MNPs成功結(jié)合到S. aureus的表面。確定了MNPs探針和兩種寡核苷酸（捕獲探針和信號探針）的最佳濃度。在最佳條件下，建立了S. aureus濃度與熒光峰面積之間的相關(guān)性，并確定了檢測限為3 CFU/mL。驗(yàn)證了該方法在實(shí)際樣品（如經(jīng)過紫外線消毒的瓶裝水和自來水）中檢測S. aureus的潛力，結(jié)果與平板計(jì)數(shù)法獲得的結(jié)果相似，表明該設(shè)備具有實(shí)際應(yīng)用潛力。

Fig. 4. (A) Effect of MNPs concentration on fluorescent peak area. (B) Effect of biotin-aptamer Ⅰ concentration on bacteria capture rate. (C) Effect of FAM-Aptamer Ⅱ concentration on fluorescent peak area. Calibration curves of detecting different concentration of S. aureus (D) 90 μL (E) 450 μL. (F) The specificity analysis of the proposed method (Bacterial concentrations were 3.3×10⁴ CFU/mL, 2.4×10⁴ CFU/mL, 3.2×10⁴ CFU/mL, 2.3×10⁴ CFU/mL, 1.6×10⁴ CFU/mL, 2.7×10⁴ CFU/mL, respectively).

結(jié)論：該研究成功地在毛細(xì)管中集成了分離、富集和在線檢測，并將檢測目標(biāo)從DNA擴(kuò)展到蛋白質(zhì)和病原細(xì)菌，拓寬了應(yīng)用范圍。該方法具有高特異性和操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)快速的分離、富集和檢測，為環(huán)境檢測和疾病診斷提供了一個(gè)有前景的工具。

參考文獻(xiàn)：[1] CHENG S T, MENG R R, PANG Y H, et al. In-capillary magnetic separation and enrichment coupled with laser-induced fluorescence for rapid determination of biomolecules[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2024. DOI:10.1016/j.snb.2024.136840.

來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~孫健.