食品中霉菌毒素的污染是一個(gè)嚴(yán)重的全球性問題。其中,赭曲霉毒素A (Ochratoxin A, OTA)是最毒性最高、分布最廣的真菌毒素之一。OTA在人畜中可引起各種不良健康影響,并對(duì)全球經(jīng)濟(jì)和國(guó)際貿(mào)易造成損害。因此,通過有效的檢測(cè)方法監(jiān)測(cè)食品和原料中OTA的含量對(duì)于確保食品安全至關(guān)重要。

目前用于OTA檢測(cè)的傳統(tǒng)方法，如高效液相色譜(HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)等,存在儀器昂貴、樣品前處理復(fù)雜、檢測(cè)過程時(shí)間長(zhǎng)以及受基質(zhì)干擾等缺點(diǎn)。免疫分析法作為一種快速檢測(cè)OTA的有力工具,由于其靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。但傳統(tǒng)免疫分析法依賴于人工合成的毒素類似物作為競(jìng)爭(zhēng)性抗原,存在合成路徑復(fù)雜、批次誤差大以及環(huán)境污染等問題。近年來，許多研究報(bào)道了利用模擬肽和抗獨(dú)特型抗體等替代品來取代人工合成的抗原用于免疫分析，但大多數(shù)仍與單克隆抗體結(jié)合。

本研究以O(shè)TA特異性單域抗體Nb28和其特異性結(jié)合的模擬肽Y4為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)了一種基于比色學(xué)比率的生物發(fā)光免疫傳感器(RBL-免疫傳感器),用于快速、便攜、靈敏的OTA檢測(cè)。該傳感器由三個(gè)組分組成:Nb28-大片段納米發(fā)光素(NLg)、多價(jià)Y4-小片段納米發(fā)光素(MPSm)和綠色增強(qiáng)納米光子(GeNL)。NLg與MPSm的特異性結(jié)合會(huì)引起納米發(fā)光素的重組,產(chǎn)生藍(lán)光發(fā)射;而GeNL能通過生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)產(chǎn)生綠光發(fā)射。OTA的濃度變化可通過微孔板讀數(shù)機(jī)測(cè)量的發(fā)射峰強(qiáng)度比(λ₄₅₈/λ₅₁₈)以及智能手機(jī)拍攝的圖像的藍(lán)/綠通道比值進(jìn)行定量檢測(cè)。與單一信號(hào)的傳感器相比,該RBL-免疫傳感器顯示出更穩(wěn)定的檢測(cè)性能,不受外部因素的影響。

結(jié)果與討論

1 標(biāo)記蛋白的表達(dá)與純化

將編碼MPSm和GeNL的重組表達(dá)載體pET25b-MPSm和pET25b-GeNL轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)菌株,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)并利用Ni-NTA親和層析柱純化得到目標(biāo)蛋白。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,經(jīng)純化的NLg、MPSm和GeNL在還原條件下均呈現(xiàn)單一條帶,分子量分別約為35.5 kDa、11.8 kDa和47.7 kDa,與預(yù)期一致。其中,MPSm作為一種七聚體結(jié)構(gòu)的融合蛋白,在非還原條件下呈現(xiàn)約82.6 kDa的條帶。

2. 傳感器的工作機(jī)理驗(yàn)證

進(jìn)一步驗(yàn)證了MPSm作為Nb28的識(shí)別元件,以及NLg-MPSm結(jié)合是否能夠誘導(dǎo)納米發(fā)光素的重組并產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)。結(jié)果表明,在沒有OTA存在時(shí),"NLg+MPSm"傳感器可產(chǎn)生約460 nm的明顯發(fā)光峰;而加入100 ng/mL OTA后,峰值信號(hào)消失,證實(shí)了MPSm與NLg之間的特異性競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。此外,引入校準(zhǔn)酶GeNL作為內(nèi)參后,"NLg+MPSm+GeNL"傳感器在無OTA存在時(shí)可同時(shí)觀察到約460 nm和520 nm的兩個(gè)明顯發(fā)光峰;而加入100 ng/mL OTA后,460 nm處的發(fā)光峰顯著降低。這進(jìn)一步驗(yàn)證了上述設(shè)計(jì)推測(cè)的反應(yīng)過程。

通過SPR動(dòng)力學(xué)測(cè)試,NLg和MPSm的平衡解離常數(shù)KD為1.25 μM,遠(yuǎn)高于Lg和Sm的內(nèi)在親和力(KD=190 μM),表明二者之間具有更強(qiáng)的相互作用。與單一發(fā)光信號(hào)的傳感器相比,引入GeNL后的RBL-免疫傳感器在持續(xù)時(shí)間內(nèi)保持了穩(wěn)定的發(fā)光信號(hào)比值,不受基質(zhì)消耗的影響。這歸因于納米發(fā)光素和校準(zhǔn)酶GeNL同時(shí)催化底物而產(chǎn)生的雙信號(hào)變化是同步的,因此信號(hào)比值變化更加穩(wěn)定持久。

3. RBL-免疫傳感器的優(yōu)化

為獲得RBL-免疫傳感器對(duì)OTA的最佳檢測(cè)性能,優(yōu)化了NLg、MPSm和GeNL的濃度等關(guān)鍵參數(shù)。首先通過發(fā)光成像技術(shù),確定了NLg和MPSm的最佳濃度比,以實(shí)現(xiàn)免疫傳感器的可視化檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用校正曲線法優(yōu)化了GeNL的濃度。結(jié)果顯示,當(dāng)NLg、MPSm和GeNL的質(zhì)量濃度分別為0.5 μM、0.25 μM和0.125 μM時(shí),免疫傳感器表現(xiàn)出最佳的發(fā)光信號(hào)和檢測(cè)靈敏度。

4. RBL-免疫傳感器的性能評(píng)估

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,利用微孔板讀數(shù)機(jī)和智能手機(jī)分別對(duì)免疫傳感器的檢測(cè)性能進(jìn)行了評(píng)估。微孔板讀數(shù)機(jī)測(cè)定結(jié)果顯示,傳感器的檢測(cè)限(LOD)為0.98 ng/mL,動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍為1.56-1000 ng/mL;而基于智能手機(jī)圖像分析的檢測(cè)限為1.89 ng/mL,動(dòng)態(tài)范圍為3.13-1000 ng/mL。兩種檢測(cè)方式下的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合良好,表明該免疫傳感器具有優(yōu)異的檢測(cè)性能。

為評(píng)價(jià)傳感器的選擇性,除OTA外還考察了6種其他常見真菌毒素(OTB、OTC、AFB1、DON、ZEN和FB1)對(duì)其的交叉反應(yīng)性。結(jié)果表明,所有其他毒素的半數(shù)抑制濃度(IC50)遠(yuǎn)高于OTA,表明該傳感器具有良好的選擇性。此外,通過回收實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了傳感器在黑胡椒和白胡椒樣品中的準(zhǔn)確性,回收率在85.2%-115.3%之間,滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。

最后,該RBL-免疫傳感器還成功應(yīng)用于10種商品胡椒粉樣品中OTA含量的檢測(cè),并與HPLC分析結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比驗(yàn)證。兩種方法測(cè)定結(jié)果吻合良好,進(jìn)一步證實(shí)了該傳感器作為一種快速、靈敏、可靠的OTA檢測(cè)工具的潛力。

結(jié)論：本研究以O(shè)TA特異性單域抗體Nb28和其結(jié)合的模擬肽Y4為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)并開發(fā)了一種基于比色學(xué)比率的生物發(fā)光免疫傳感器,實(shí)現(xiàn)了OTA的快速、便攜和可視化檢測(cè)。該傳感器由NLg、MPSm和GeNL三個(gè)組分組成,通過NLg與MPSm的特異性結(jié)合誘導(dǎo)納米發(fā)光素重組,產(chǎn)生藍(lán)光發(fā)射;同時(shí)GeNL能通過BRET產(chǎn)生綠光發(fā)射。OTA的濃度變化可通過微孔板讀數(shù)機(jī)測(cè)量的發(fā)射峰強(qiáng)度比(λ₄₅₈/λ₅₁₈)以及智能手機(jī)拍攝的圖像的藍(lán)/綠通道比值進(jìn)行定量檢測(cè)。與單一信號(hào)檢測(cè)相比,該RBL-免疫傳感器表現(xiàn)出更穩(wěn)定的檢測(cè)性能,不受外部因素的干擾。優(yōu)化后的傳感器在微孔板讀數(shù)機(jī)和智能手機(jī)上分別具有0.98 ng/mL和1.89 ng/mL的檢測(cè)限,并顯示出良好的選擇性和準(zhǔn)確性。該傳感器成功應(yīng)用于商品胡椒粉樣品中OTA的快速檢測(cè),為食品安全監(jiān)控提供了一種新的可靠工具。該工作為設(shè)計(jì)基于納米抗體和模擬肽的便攜式生物發(fā)光免疫傳感器提供了新思路,具有廣泛的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：Xie, X.; Yang, X.; Zhang, Y.; Mao, F.; He, Z.; Sun, Z.; Zhang, S.; Liu, X., Ready-to-use ratiometric bioluminescence immunosensor for detection of ochratoxin a in pepper. Biosens. Bioelectron. 2024, 259, 116401.

來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~曹璐璐。