單核細(xì)胞增生李斯特菌和沙門氏菌是奶制品中引起食源性疾病的常見病原體?？焖俸蜏?zhǔn)確的檢測對(duì)于有效控制其感染至關(guān)重要。然而沙門氏菌等傳統(tǒng)檢測靶標(biāo)在特異性和敏感性方面存在不足，可能導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。qPCR技術(shù)無法區(qū)分來自非活細(xì)胞和活細(xì)胞的DNA擴(kuò)增，因此可能因非活細(xì)胞或受損細(xì)胞中的DNA泄漏而導(dǎo)致假陽性結(jié)果。盡管PMA可以選擇性地與非活細(xì)胞的DNA結(jié)合并抑制其擴(kuò)增，但Rey等人的研究表明，單獨(dú)的PMA處理可能無法完全抑制非活細(xì)胞的DNA擴(kuò)增，特別是在細(xì)胞碎片存在的情況下。

作者在研究中采用了多種方法來提高同時(shí)檢測牛奶中單核細(xì)胞增生李斯特菌和沙門氏菌活菌的效率和準(zhǔn)確性。作者制備了直徑為20納米的金納米顆粒（AuNPs），并評(píng)估了其對(duì)qPCR系統(tǒng)熒光信號(hào)的增強(qiáng)效果。將AuNPs應(yīng)用于雙重qPCR系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著提高系統(tǒng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而提高了檢測的靈敏度。其次使用生物信息學(xué)方法篩選針對(duì)L. monocytogenes（AX10_RS05385）和Salmonella（SEEP-A511_RS03120）的高度特異性引物，將篩選出的特異性引物組合，構(gòu)建一個(gè)能夠同時(shí)檢測L. monocytogenes和Salmonella的雙重qPCR系統(tǒng)。探索雙重qPCR中的最佳引物對(duì)比例（3:1），以平衡兩個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)。之后引入丙酸丙酯（PMA）作為活細(xì)胞DNA選擇性染料，以區(qū)分活細(xì)胞和非活細(xì)胞的DNA。探索并確定了最佳的PMA處理?xiàng)l件，包括PMA濃度（20μM）、孵育時(shí)間（8分鐘）和曝光時(shí)間（5分鐘），以最大程度地抑制非活細(xì)胞的DNA擴(kuò)增。在PMA處理前，使用0.01%的十二烷基硫酸鈉（SD）進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)非活細(xì)胞DNA擴(kuò)增的抑制效果，使檢測更加準(zhǔn)確。利用金納米顆粒（AuNPs）增強(qiáng)qPCR的檢測信號(hào)，從而提高檢測系統(tǒng)的靈敏度。

作者又對(duì)DNA提取、qPCR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。采用熱裂解法代替?zhèn)鹘y(tǒng)DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，該方法僅需15分鐘，且更適合現(xiàn)場檢測。使用兩步擴(kuò)增法優(yōu)化qPCR反應(yīng)條件，兩個(gè)步驟同時(shí)在60℃進(jìn)行，以減少循環(huán)中溫度升降過程所需的時(shí)間。通過這些方法和策略，作者成功地開發(fā)出了一種靈敏度高、特異性好、檢測時(shí)間短的雙重qPCR系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠同時(shí)檢測牛奶中的L. monocytogenes和Salmonella活菌。這不僅提高了檢測的準(zhǔn)確性和效率，還為食品安全檢測提供了一種有力的工具。

在人工污染的牛奶中進(jìn)行AuNPs-SD-PMA-qPCR檢測，驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性、靈敏度和特異性。比較不同方法（如qPCR、PMA-qPCR和AuNPs-SD-PMA-qPCR）在檢測活菌和非活菌方面的差異。并且通過對(duì)一系列不同濃度的活菌樣品進(jìn)行檢測，評(píng)估了AuNPs-SD-PMA-qPCR方法的靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能夠準(zhǔn)確檢測到低至5×101CFU/g的活菌。通過與常見食品致病菌如大腸桿菌（E. coli）和檸檬酸桿菌（Citrobacter spp.）等進(jìn)行交叉檢測，驗(yàn)證了該方法的特異性。通過標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)了AuNPs-SD-PMA-qPCR方法在實(shí)際樣品檢測中的準(zhǔn)確性和可靠性。

綜上所述，作者通過一系列精心設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)，成功地開發(fā)并優(yōu)化了一種快速、高特異性和高敏感性的方法，用于同時(shí)檢測牛奶產(chǎn)品中的L. monocytogenes和Salmonella活菌。

圖1所示。(A)引物AX10_RS05385和SEEPA511_RS03120 qPCR擴(kuò)增曲線。(B) qPCR檢測引物AX10_RS05385和SEEPA511_RS03120的熔化曲線。(C) AX10_RS05385:SEEPA511_RS03120不同引物比例的擴(kuò)增曲線。(D) AX10_RS05385:SEEPA511_RS03120不同引物配比的熔化曲線。

圖2所示。PMA處理的優(yōu)化。不同濃度PMA對(duì)L. monocytogenes(A)和Salmonella (B)的影響;不同孵育時(shí)間對(duì)L. monocytogenes (C)和Salmonella (D) 的影響;不同暴露時(shí)間對(duì)L. monocytogenes(E)和 Salmonella (F)的影響。不同的小寫字母表示非活細(xì)胞組間擴(kuò)增結(jié)果(Ct值)有顯著差異(p < 0.05)，不同的大寫字母表示活細(xì)胞組間擴(kuò)增結(jié)果(Ct值)有顯著差異(p < 0.05)。

圖3所示。不同SD濃度對(duì)L. monocytogenes(A)和Salmonella (B)的影響。(C) AuNPs、AgNPs、PEI@Fe3O4和銀納米線對(duì)SD- pma - qpcr系統(tǒng)ΔRn值的影響。(D) AuNPs- SD-PMA-qPCR和SD-PMA-qPCR的擴(kuò)增曲線。不同小寫字母表示不同非活細(xì)胞組間擴(kuò)增結(jié)果(Ct值)差異顯著(p < 0.05)，不同大寫字母表示不同活細(xì)胞組間擴(kuò)增結(jié)果(Ct值)差異顯著(p < 0.05)。

圖4所示。應(yīng)用AuNPs-SD-PMA-qPCR、PMA-qPCR和qPCR技術(shù)鑒別L. monocytogenes(A)和Salmonella (B)的活/非活細(xì)胞。(C) AuNPs-SD-PMA-qPCR檢測的特異性。(D-E)不同梯度稀釋L. monocytogenes和Salmonella的擴(kuò)增曲線。(F)不同梯度稀釋的L. monocytogenes和Salmonella的熔化曲線。不同小寫字母表示不同檢測方法擴(kuò)增結(jié)果(Ct值)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p < 0.05)。

DOI: 10.1016/j.foodcont.2024.110711

來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~魏文杰。