維持細胞正常的生理活動，需要細胞膜內(nèi)外的物質(zhì)交換。在這一過程中，細胞膜內(nèi)外的離子濃度及差異具有重要的生理意義。它不僅調(diào)節(jié)存在于細胞膜和細胞器上的質(zhì)子依賴性轉(zhuǎn)運蛋白的活性，而且還影響脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等細胞內(nèi)的生化反應(yīng)。

由于這一生物學過程受酸堿平衡的影響較大，并極其敏感，因此，在細胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液的pH值必須維持在適宜水平，并能隨著時間的推移保持穩(wěn)定。

目前，大多數(shù)（但不是全部）細胞培養(yǎng)液采用碳酸鹽緩沖體系，以控制和穩(wěn)定pH值，通常通過添加一定量的碳酸氫鈉來實現(xiàn)。在生物體內(nèi)，碳酸鹽-二氧化碳（CO2）緩沖系統(tǒng)可以由肺（CO2）和腎臟（碳酸氫鹽）來主動調(diào)節(jié)，使pH值保持在一個最佳水平，而在細胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)箱中的二氧化碳可與培養(yǎng)液中的碳酸氫鹽共同作用，以實現(xiàn)這一目的。

不同動物細胞適用的培養(yǎng)液pH值有所不同，多數(shù)哺乳動物細胞在pH值為7.2-7.4時生長良好。當然，這是理想數(shù)值，在實際工作中，會發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)液的pH值會隨著時間發(fā)生變化。比如，在不更換培養(yǎng)液的情況下，細胞培養(yǎng)一段時間后，會注意到培養(yǎng)液變?yōu)槌赛S色。

顏色上的變化，來源于培養(yǎng)液中添加的pH指示劑 — 酚紅。含有酚紅的溶液在pH值為6.8及以下時呈現(xiàn)黃色。隨著pH值的上升，顏色會逐漸變紅，直至達到7.6 時，溶液呈現(xiàn)出粉紅色，在pH值為8.2以上時又變成明亮的紫紅色（見下圖）。這些可視化的改變，可幫助我們快速判斷細胞的生長情況。

（Phenol red, 40 μM: colors in cell culture medium at a pH range from 6.0 to 8.0 Created by Max Schwalbe）

一般來說，培養(yǎng)液呈橙紅色，這是哺乳動物細胞生長的健康的pH值條件，此時pH值為7.0-7.7。如果顏色呈亮黃色（過酸）或紫紅色（過堿），說明細胞生長出現(xiàn)了狀況。

一方面，培養(yǎng)液通常會或多或少的酸化。細胞生長過密或時間過長，酸性代謝產(chǎn)物累積會導致培養(yǎng)液pH值下降；此外，若培養(yǎng)液被細菌和酵母菌污染且過度生長，pH值也會下降；而低氧條件下的培養(yǎng)液pH值也會降低，因為低氧環(huán)境促進了細胞代謝的乳酸堆積。

另一方面，當培養(yǎng)液開封后在冰箱中放置的時間過長，或者培養(yǎng)箱中的二氧化碳水平降低，會觀察到培養(yǎng)液變成紫紅色，此時，培養(yǎng)液的pH值升高。

實際上，培養(yǎng)液中基于碳酸鹽的緩沖體系是為培養(yǎng)箱中特定的CO2水平而配制的。一些細胞類型可能更喜歡培養(yǎng)液中更高或更低的碳酸氫鹽濃度，這就要求在細胞培養(yǎng)液的孵化過程中采用更高或更低的CO2濃度，以維持生理上的pH值。

由于室內(nèi)空氣中的CO2含量要低得多（低于1%），即使是輕微的干擾，例如打開培養(yǎng)箱的門，也會導致培養(yǎng)箱內(nèi)CO2水平的改變。與此同時，由于水的解離常數(shù)會隨著溫度的降低而降低，都會對培養(yǎng)液的pH值造成影響。

因此，基于讓細胞和培養(yǎng)液保持在恒定的CO2濃度和溫度下的原則，在培養(yǎng)箱外進行細胞操作時，應(yīng)盡量減少操作時間，在從培養(yǎng)箱取出細胞之前，應(yīng)準備好細胞操作需要的其他材料，同時，培養(yǎng)液溫度至少要恢復到室溫，以減少細胞對低溫的應(yīng)急反應(yīng)。

為減少CO2水平以及溫度變化給培養(yǎng)液和細胞帶來的影響，在培養(yǎng)箱外處理細胞時，可考慮使用添加非碳酸鹽緩沖劑（如HEPES緩沖液）的培養(yǎng)液。

HEPES的解離常數(shù)隨著溫度的下降而下降，這點與水類似，這種特性使得HEPES緩沖體系更適應(yīng)培養(yǎng)箱外的室溫環(huán)境和較低的CO2水平，這在維持細胞生理功能方面優(yōu)于碳酸鹽緩沖體系。但如果培養(yǎng)液長時間接收光照，HEPES會與培養(yǎng)液中的色氨酸及其他成分發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生對細胞有害的活性氧（自由基），影響細胞的正常生理功能。因此使用含有HEPES的培養(yǎng)液，最好將培養(yǎng)液瓶用鋁箔紙覆蓋以避免光照。

基于上述原因，除非必要，盡量不要使用含有HEPES的培養(yǎng)液，尤其在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞時。盡管含HEPES的培養(yǎng)液能夠維持更恒定的pH值，即使細胞過度增殖，培養(yǎng)液也不容易變黃，但這并非使用含HEPES培養(yǎng)液的目的。恰恰相反，加入酚紅指示劑的目的之一就是通過培養(yǎng)液的顏色變化來及時了解細胞的生長狀態(tài)，從這個角度考慮，含HEPES的培養(yǎng)液也不適合用來長期培養(yǎng)細胞。

簡言之，細胞培養(yǎng)，就是要為細胞提供最適宜的生長環(huán)境，以保持細胞培養(yǎng)初始時的群體狀態(tài)。這個要求苛刻而必要，需要從業(yè)者近乎呆板的堅守各種常規(guī)、操作細節(jié)，科研不易，堅守也是把鑰匙。

來源：“信睿生物”公眾號
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